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目的:1.建立局部视网膜内铁离子过载的动物模型。探究视网膜内铁离子过载导致的视网膜退行性改变。2.探究视网膜内铁离子过载导致年龄相关性黄斑变性(Age-related macular degeneration,AMD)的发生机制。3.探究氘代二十二碳六烯酸(Deuterated-docosahexaenoic acid,D-DHA)对铁离子导致AMD改变的保护作用。4.探究膜铁转运蛋白和铜蓝蛋白对视网膜细胞内铁离子运输的调控作用。方法:1.利用C57BL/6野生型小鼠,给予玻璃体腔内注射铁离子和生理盐水溶剂对照,诱导视网膜细胞内铁离子过载,建立视网膜内铁离子过载动物模型。注射后2天和7天,利用彩色眼底照相、光学相干断层扫描成像和共聚焦激光眼底扫描检查视网膜形态学改变;利用暗适应视网膜电图检查视网膜功能。利用TUNEL染色,探究视网膜细胞凋亡。利用铁蛋白轻链抗体免疫荧光染色和普鲁士蓝染色,探究视网膜内铁离子含量。注射后1个月到6个月,利用彩色眼底照相、光学相干断层扫描成像、共聚焦激光眼底扫描检查和荧光血管造影检测,探究视网膜铁过载导致的慢性视网膜退行性改变。利用甲苯胺蓝染色法,评估视网膜形态改变。2.利用玻璃体腔内注射铁离子,建立视网膜铁过载动物模型。利用荧光显微镜观察视网膜冰冻切片的自发荧光改变。利用TOMM20抗体和花生凝集素免疫荧光标记,探究自发荧光在视网膜细胞的定位。利用高效液相色谱分析检测类视色素二聚体含量,探究自发荧光物质成分。利用免疫荧光染色标记,探究视网膜内氧化应激反应、脂质过氧化反应、以及小胶质细胞/巨噬细胞的活化和迁移。利用q PCR检测视网膜细胞内参与铁代谢调节、氧化应激、炎症反应和补体通路相关基因表达水平。3.给予C57BL/6野生型小鼠D-DHA或DHA处理,利用质谱分析,探究视网膜组织内D-DHA含量。小鼠分别给予D-DHA或DHA预处理1-4周,给予玻璃体内注射铁离子或生理盐水溶剂对照。注射后1周和4周,利用共聚焦激光眼底扫描、光学相干断层扫描检查,探究视网膜形态学改变。利用暗适应视网膜电图检查视网膜功能。利用甲苯胺蓝染色,观察视网膜结构,定量分析视网膜厚度改变。利用免疫荧光染色,检测DHA的脂质过氧化反应和视网膜内铁含量。利用q PCR检测视网膜细胞内参与氧化应激、铁代谢调节、炎症反应和补体通路相关基因的表达水平。4.利用Cre-Lox系统,将m Rx-Cre+鼠系和Fpn floxed鼠系进行杂交,建立条件性敲除视网膜Fpn小鼠动物模型(m Rx Cre+,Fpn Flox/Flox)。利用系统性敲除Cp鼠,建立条件性敲除视网膜Fpn和系统性敲除Cp的动物模型(Cp-/-,m Rx Cre+,Fpn Flox/Flox)。利用腹腔注射右旋糖酐铁,诱导循环铁离子过载条件。利用免疫荧光法检测视网膜内的铁蛋白含量。利用q PCR检测视网膜细胞内相关基因表达水平。结果:1.与生理盐水注射眼相比,铁离子注射后4h、2天和7天,彩色眼底检查可见视网膜色素减退和自发荧光增强,共聚焦激光眼底扫描像可见高自发荧光和低自发荧光改变,OCT扫描像可见视网膜外核层改变。暗适应视网膜电图结果,发现铁离子导致视锥视杆细胞受损。TUNEL染色可见铁离子导致视网膜细胞凋亡。Ft-L抗体免疫荧光标记和普鲁士蓝染色,发现视网膜内铁离子含量增加。注射后1个月到6个月,共聚焦激光眼底扫描、OCT扫描和甲苯胺蓝染色发现铁离子视网膜地图样萎缩形成和进展,荧光血管造影发现新生血管形成。Iba1抗体免疫荧光标记,发现铁离子导致视网膜内出现小胶质细胞/巨噬细胞活化和迁移。2.注射后4h,铁离子导致的自发荧光积聚在TOMM20抗体标记的光感受器细胞内节处的线粒体。注射后2天,铁离子导致的自发荧光积聚在视杆细胞外节。注射后内1周,高效液相色谱分析发现铁离子导致视网膜内全反式视黄醛二聚体积累。注射后2天,铁离子导致视网膜内8-Ohd G和CEP抗体免疫荧光染色增强,提示RPE细胞发生DNA氧化应激损伤和DHA的脂质过氧化产物积累;Iba1抗体和CD68抗体免疫荧光标记的小胶质细胞/巨噬细胞发生活化和迁移。q PCR法检测视网膜细胞内个基因的m RNA表达水平,发现铁离子注射后视网膜细胞内Tfrc表达下调,氧化应激反应调节基因Hmox1、Sod1、Cat表达上调,IL-1β、IL-6和C3表达上调,提示铁离子注射后导致视网膜细胞内铁离子过载,发生氧化应激反应、炎症反应和补体通路激活。3.质谱分析发现D-DHA有效结合到视网膜组织,组织含量与给药时间成正比。D-DHA/DHA给药后4周,玻璃体腔内注射铁离子后1周,视网膜组织内DDHA含量无显著改变,提示未发生脂质过氧化反应。共聚焦激光眼底扫描像可见D-DHA/Fe组视网膜自发荧光显著减少,D-DHA对铁离子导致的视网膜自发荧光呈现剂量依赖性抑制作用,D-DHA预处理4周完全保护视网膜防止铁离子导致的视网膜自发荧光和退行性改变。暗适应视网膜电图结果提示D-DHA给药后4周对视网膜功能未见影响。注射后1周,DHA/Fe组视锥视杆细胞功能受损,D-DHA/Fe组视锥视杆细胞功能正常。甲苯胺蓝染色可见DHA/Fe组发现视网膜退行性改变,而D-DHA/Fe组视网膜结构完整。与saline组相比,D-DHA/Fe组和DHA/Fe组视网膜中Ft-L抗体免疫荧光标记增强,提示视网膜内铁离子含量增加。DHA/Fe组可见CEP免疫荧光标记,而D-DHA/Fe未见标记,提示D-DHA抑制铁离子诱导的脂质过氧化反应。q PCR法检测视网膜细胞内个基因的m RNA表达水平,发现铁离子导致D-DHA/Fe组和DHA/Fe组视网膜细胞内Tfrc表达下调,提示视网膜细胞内铁含量增加。DHA/Fe组视网膜内氧化应激反应调节基因Hmox1、Sod1、Cat表达上调,IL-1β、IL-6和C3表达上调,提示铁离子导致氧化应激反应、炎症反应和补体通路激活;D-DHA/Fe组与D-DHA/saline组视网膜细胞的各基因表达水平无显著差异,提示D-DHA抑制铁离子导致的氧化应激、炎症反应和补体通路激活。4.条件性敲除视网膜细胞内Fpn未导致视网膜细胞内铁离子过载。实验组(m Rx Cre+,Fpn Flox/Flox)和对照组(m Rx Cre+,Fpn Flox/+)相比,Ft-L免疫荧光染色结果未见显著差异,视网膜细胞中Tfrc的m RNA的相对表达水平未见显著差异。Cp-/-,m Rx Cre+,Fpn Flox/Flox鼠视网膜细胞Cp和Fpn基因m RNA表达水平显著下调,提示条件性敲除视网膜Fpn和系统性敲除Cp基因。Cp-/-,m Rx Cre+,Fpn Flox/Flox基因敲除小鼠视网膜细胞内Tfrc的m RNA表达水平显著下调,提示视网膜细胞内铁离子增加。结论:1.视网膜铁过载导致视网膜发生AMD改变:光感受器细胞和RPE细胞凋亡,自发荧光物质积累,慢性进展性地图样萎缩改变和新生血管形成。2.视网膜铁过载导致AMD的相关机制包括:铁离子导致氧化应激损伤,DHA发生脂质过氧化反应,类色素二聚体物质形成,小胶质细胞/巨噬细胞的活化和迁移、炎症和补体通路激活。3.D-DHA有效结合到视网膜组织,对正常视网膜结构和功能未见影响。DDHA通过抑制脂质过氧化反应防止铁离子导致的视网膜氧化应激损伤,保护视网膜防止地图样萎缩形成。4.视网膜细胞内铁离子输出不依赖于膜铁转运蛋白介导。膜铁转运蛋白和铜蓝蛋白协同介导视网膜细胞内铁离子输出。5.本动物模型可用于以下疾病的发病机制和药物治疗的研究,包括年龄相关性黄斑变性、氧化应激相关的视网膜退行性改变、铁代谢异常相关的退行性改变、抗氧化应激药物、抗新生血管药物等。D-DHA通过抑制脂质过氧化反应防止氧化应激相关的AMD改变,提供了重要的临床前研究数据,为干性AMD的治疗提供了新策略。