论文部分内容阅读
多发性硬化(MS)是一种以中枢神经系统(CNS)白质脱髓鞘为特征的自身免疫性疾病。目前MS的缓解期治疗以DMT药物为主,但其疗效有限,且可能出现严重的不良反应,因此探寻新的治疗方法极为重要。实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)作为MS的经典动物模型,在MS的科学研究中被广泛应用。CD4+T细胞中的两种细胞亚型Th1、Th17可释放促炎性细胞因子,破坏血脑屏障,并向中枢迁移,诱导CNS炎症,导致白质脱髓鞘。CD4+T细胞的另外两种细胞亚型Th2、Treg在MS中则可发挥抗炎作用,抑制自身免疫反应,并促进髓鞘的再生修复。因此,通过调控CD4+T细胞分化,即抑制Th1、Th17分化,促进Th2、Treg分化有利于抑制MS的疾病进展。巨噬细胞在MS中具有双重作用,包括促炎型巨噬细胞(M1)和抗炎型巨噬细胞(M2)。M1主要通过分泌促炎性细胞因子,促进CNS炎症反应、白质脱髓鞘,加重MS;M2则可分泌抗炎性细胞因子,抑制自身炎症反应,促进髓鞘和轴突的再生修复,缓解MS症状。因此,找寻新的靶点来调控巨噬细胞极化,即减少M1极化,促进M2极化可能成为MS治疗的新方向。sPD-L1是程序性死亡受体-配体1(PD-L1)的可溶性形式,由活化的免疫细胞表面PD-L1膜型分子蛋白解离并释放入血,sPDL1可与免疫细胞表面的PD-1结合,发挥负性免疫调节作用。有研究发现PD-L1融合蛋白可减轻EAE的临床症状,但具体机制尚未阐明。研究目的:本研究旨在明确sPD-L1对EAE的治疗作用,阐明sPD-L1对CD4+T细胞的分化、增殖、凋亡、迁移的调节作用;明确sPD-L1对巨噬细胞的极化、迁移等的调节作用;并进一步探索sPD-L1对CD4+T细胞、巨噬细胞发挥免疫调节作用的具体机制。以期为MS的临床治疗提供新的靶点和理论依据。研究方法:(1)将C57BL/6小鼠随机分为对照组(EAE组)和sPD-L1组,将MOG35-55肽段、完全弗氏佐剂(FCA)、结核菌素混合形成的乳化液注射于两组小鼠背部皮下,并在免疫当天和间隔48小时后给予小鼠腹腔注射百日咳毒素(PTX),成功建立EAE模型,并在建模之日起,每日对小鼠进行体重称量、行为学评分直至高峰期。期间在两组小鼠出现首发临床症状时,sPD-L1组小鼠给予sPD-L1腹腔注射,对照组小鼠给予等体积PBS腹腔注射,均连续给药5天,直至高峰期处死两组小鼠取材,进行相关检测。(2)高峰期处死两组小鼠并取材:(1)取小鼠脊髓并制作石蜡切片,进行HE染色和LFB髓鞘染色;(2)用流式细胞学技术分析两组小鼠脾脏中:Th1、Th2、Th17、Treg、M1、M2比例;CD4+T细胞和巨噬细胞中CCR3和CCR7表达情况;CD4+T细胞和M1、M2巨噬细胞表面PD-1、PD-L1的表达情况;CD4+T细胞凋亡情况;(3)用CCK8法检测两组小鼠脾脏中淋巴细胞增殖情况;(4)取小鼠脊髓进行免疫荧光染色,检测小鼠脊髓中Th1、Th17、M1、M2浸润情况;(5)取小鼠眼球血,并分离血清,用CBA法检测细胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF-α和IFN-γ分泌水平;(6)提取小鼠腹腔巨噬细胞,运用流式细胞学技术对其M1、M2分型占比进行检测,并对巨噬细胞的吞噬功能进行测定。(3)探究机制:高峰期处死两组小鼠,运用磁珠分选技术提取小鼠脾脏中CD4+T细胞、巨噬细胞,运用Western Blot检测二者中PI3K、Akt、m TOR蛋白及其磷酸化激活形式p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白的表达情况。(4)验证机制:将小鼠随机分为对照组(EAE组)、sPD-L1组、sPDL1+PI3K激动剂组、sPD-L1+PI3K阻断剂组。其中sPD-L1+PI3K激动剂组小鼠发病后在给予sPD-L1注射的同时,联合PI3K激动剂740 Y-P进行腹腔注射;sPD-L1+PI3K阻断剂组小鼠发病后给予sPD-L1注射的同时,联合PI3K阻断剂LY294002进行腹腔注射。每日对4组小鼠进行体重称量和行为学评分,直至高峰期处死取材,运用磁珠分选技术分离出4组小鼠脾脏的CD4+T细胞、巨噬细胞后,运用Western Blot检测二者中p-Akt、p-m TOR蛋白表达水平,运用流式细胞学技术分析4组中Th1、Th2、Th17、Treg、M1、M2占比。研究结果:(1)行为学评分:sPD-L1组小鼠行为学评分与对照组相比显著降低,对照组小鼠在高峰期时临床症状评分达3.25±0.42分,其中最重评分为3.5分,sPD-L1组小鼠在高峰期时临床症状评分达1.30±0.54分,其中最重评分为2分,两组间差异有统计学意义。(2)(1)小鼠脊髓HE染色:与对照组相比,sPD-L1组中小鼠脊髓中炎性细胞浸润显著减少,神经纤维排列整齐;LFB染色:与对照组相比,sPD-L1组小鼠脊髓中空泡样改变显著减少,脱髓鞘显著减轻。(2)小鼠脾脏流式细胞学技术分析:1)与对照组相比,sPD-L1组中Th1、Th17显著减少,Treg、M2显著增多;Th2、M1在两组中无统计学差异。2)与对照组相比,sPD-L1组CD4+T细胞上PD-1表达显著增多,两组CD4+T细胞上PD-L1的表达无明显差异;sPDL1组中M1和M2上PD-1、PD-L1表达均高于对照组。3)与对照组相比,sPDL1组CD4+T细胞和巨噬细胞上CCR3表达显著上调,CCR7表达显著下降。4)与对照组相比,sPD-L1组中CD4+T细胞凋亡数量显著增加。(3)CCK8检测淋巴细胞增殖:与对照组相比,sPD-L1组小鼠脾脏淋巴细胞增殖在48h、72h时显著下降。(4)小鼠脊髓免疫荧光染色:与对照组相比,sPD-L1组小鼠脊髓中的Th1、Th17、M1浸润明显减少,而M2在两组中无差异。(5)小鼠血清细胞因子检测:与对照组相比,sPD-L1组中IFN-γ和IL-17A显著降低,两组血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF-ɑ无统计学差异。(6)与对照组相比,sPD-L1组小鼠腹腔M2显著增多,M1在两组中无差异;两组小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能无明显差异。(3)探究机制:与对照组相比,sPD-L1组CD4+T细胞中的p-PI3K、p-Akt、p-m TOR蛋白表达显著下降,且sPD-L1组巨噬细胞中的p-PI3K、p-Akt、pm TOR蛋白表达显著增高。两组CD4+T细胞和巨噬细胞中的PI3K、Akt、m TOR蛋白表达均无明显差异。(4)验证机制:(1)与sPD-L1组相比,sPD-L1联合PI3K激动剂组小鼠行为学评分明显增高,且该组CD4+T细胞中p-Akt、p-m TOR蛋白表达增加,Th1、Th17比例明显增高,Treg比例明显下降,两组中M2比例无明显差异。(2)与sPD-L1组相比,sPD-L1联合PI3K阻断剂组小鼠行为学评分无明显改变,该组巨噬细胞中p-Akt、p-m TOR蛋白表达下降,Th1、Th17、M2比例明显降低,Treg比例增加。(3)与sPD-L1联合PI3K激动剂组相比,sPD-L1联合PI3K阻断剂组小鼠行为学评分显著下降,该组中Th1、Th17、M2比例明显降低,Treg比例显著增加。(4)与对照组相比,sPD-L1联合PI3K阻断剂组行为学评分显著下降,且该组中Th1、Th17的比例明显降低,Treg比例显著增加,两组中M2比例无明显差异。(5)sPD-L1联合PI3K激动剂组与对照组小鼠相比行为学评分无统计学差异,但sPD-L1联合PI3K激动剂组小鼠行为学评分相对下降,且sPDL1联合PI3K激动剂组中M2比例显著升高。两组中Th1、Th17、Treg的比例无明显差异。(6)以上4组中Th2、M1比例均无明显差异。结论:(1)sPD-L1可有效抑制EAE小鼠体内免疫炎症反应,减轻其神经功能缺损症状。(2)sPD-L1可通过调控CD4+T细胞的分化、凋亡、迁移以及调控巨噬细胞的极化与迁移对EAE小鼠发挥免疫保护作用,并且与调控PI3K/Akt/m TOR信号通路有关。