变应性鼻炎（allergic rhinitis,AR）是指特应性个体鼻黏膜暴露于变应原后发生的主要由免疫球蛋白E（immunoglobulin E,Ig E）介导的的非感染性慢性炎性反应。AR主要表现为打喷嚏、鼻痒、鼻塞和流清水样涕等症状。流行病学调查表明,在过去的几十年中AR的发病率逐渐增加,目前影响全世界人口的10%～40%。AR不仅影响生活质量,也可造成巨大的社会经济负担,已经成为全球性健康问题。根据变应原种类将AR分为季节性AR和常年性AR。季节性AR常见致敏原为花粉、真菌等季节性吸入物;而常年性AR常见致敏原为户尘螨（house dust mite,HDM）、动物皮屑、蟑螂等室内常年性吸入物。花粉是季节性AR的主要变应原。由于地理条件、气候因素和人为因素,植物的分布存在明显地域性,因此造成了花粉播散的区域性特征,如蒿属花粉是我国北方地区夏秋季节最常见的变应原。HDM是常年性AR的首要变应原。HDM的分泌物、粪粒、蜕皮及螨尸都是强烈的变应原,易感人群接触或吸入后就会诱发变态反应,引发AR。然而目前对于蒿属花粉和HDM引发的AR的具体生物学机制尚不明确,尤其是二者所引起的鼻黏膜及黏膜下反应的不同没有对比研究,也造成了临床上治疗的困惑。因此开展蒿属花粉和HDM在AR发生过程中相关分子机制的探究具有重要的科学意义和临床价值。上皮屏障作为第一道防线,对于保护宿主免疫系统免受有害病原体的侵害至关重要。鼻黏膜上皮细胞作为鼻腔内部的物理屏障、化学性屏障和免疫性屏障在抵御变应原、病原体和其他外来颗粒的过程中发挥着重要作用。在对不同变应原的研究中均发现存在对鼻黏膜上皮细胞的破坏,例如蒿属花粉和HDM变应原可以破坏鼻黏膜上皮细胞间的紧密连接并促进相关炎症因子的释放。已有研究表明桦树花粉变应原可以进入鼻黏膜上皮细胞,这一过程可能是由于小窝蛋白相关的内吞途径介导的,而进入上皮细胞中的变应原可能会诱发上皮相关的信号通路的改变。另外,研究表明,HDM中的变应原可以引发上皮细胞相关的免疫反应,介导相关炎症因子的释放,引发变应原相关的细胞凋亡。然而目前蒿属花粉和HDM中的致敏蛋白Art v 1和Der p 1是否能够进入人鼻黏膜上皮细胞系（human nasal epithelial cells,HNEp C）,进入上皮细胞后的变应原可以与哪些蛋白质相互作用进而调节上皮细胞中具体信号通路的变化仍未见报道,因此探究Art v 1和Der p 1能否进入鼻黏膜上皮细胞,阐明变应原进入后上皮细胞中相应信号通路的改变将为阐明AR的发病机理奠定基础。因此,为了探究蒿属花粉和HDM主要致敏蛋白Art v 1和Der p 1在鼻黏膜上皮细胞中发挥的生物学作用,本研究首先对季节性与常年性AR鼻黏膜上皮细胞进行测序,明确其中的基因表达的差异并分析基因的信号通路富集。此外,我们体外表达纯化Art v 1和Der p 1蛋白,研究鼻黏膜上皮细胞中与Art v1和Der p 1相互作用的蛋白,同时对Art v 1和Der p 1蛋白刺激后的鼻黏膜上皮细胞中基因转录水平的变化进行探究,分析变应原Art v 1和Der p 1可能调节的信号通路,阐明变应原在鼻黏膜上皮中的影响及具体分子机制。主要结果如下:一、季节性与常年性AR鼻黏膜上皮细胞基因表达生物信息学分析。蒿属花粉过敏AR患者在炎症反应、TNFα/NF-κB信号通路、IL2/STAT5信号通路显著上调,可能促进炎症反应;HDM过敏AR患者在G2M、E2F、MYC显著下调,可能抑制细胞增殖。TNF与CDK1分别为有最多相互作用的蛋白,推断TNF与CDK1可能分别在蒿、HDM过敏AR中发挥重要的作用。二、HNEp C与Art v 1和Der p 1的蛋白相互作用分析。为了后续探究Art v 1和Der p 1蛋白在鼻黏膜上皮细胞中的相互作用蛋白和分析致敏蛋白刺激HNEp C后细胞中转录组学的变化,我们成功构建同时含有GST标签和His标签的原核表达载体,并在大肠杆菌中对致敏蛋白Art v 1和Der p 1进行诱导表达,使用Ni-NTA-Agarose对蛋白进行体外纯化,为后续的实验奠定基础。此外,我们体外构建表达并纯化含有绿色荧光蛋白（EGFP）的Art v 1和Der p 1融合蛋白,通过带有荧光的致敏蛋白我们发现Art v 1和Der p 1可以进入HNEp C细胞中。我们将体外表达纯化GST-Art v 1、GST-Der p 1蛋白与HNEp C细胞全蛋白进行共孵育,通过GST pull-down技术富集Art v 1和Der p 1在鼻黏膜上皮细胞中的相互作用蛋白并利用质谱技术对相互作用蛋白进行鉴定,通过对这些蛋白进行富集分析发现这些蛋白功能和信号通路主要富集在细胞间的紧密连接、细胞骨架、细胞膜、内吞途径、细胞周期和细胞凋亡。三、HNEp C接触Art v 1和Der p 1重组蛋白后差异表达基因分析。为了探究变应原Art v 1和Der p 1对HNEp C的影响,使用体外纯化的变应原Art v 1和Der p 1处理HNEp C细胞,并对处理后的细胞进行RNA-seq分析,通过高通量测序技术分析HNEp C在变应原处理后发生改变的基因,并对这些基因进行基因富集分析。通过对差异表达基因进行功能富集分析我们发现,与质谱鉴定后的蛋白质功能富集相似的是,我们同样富集到了与细胞黏附和紧密连接相关的信号通路,这表明变应原一方面可能通过与黏附蛋白相互作用裂解相关蛋白质,还可能通过转录水平调节细胞黏附和紧密连接相关蛋白的表达破坏细胞间的紧密连接和上皮细胞屏障功能。此外我们还观察到差异表达基因在细胞凋亡的正向调控、细胞增殖的负向调控和程序性坏死中存在富集。四、Art v 1和Der p 1通过影响HNEp C的细胞焦亡参与AR的发生发展。细胞焦亡作为细胞程序性坏死的一种表现形式在上皮细胞相关的炎症反应中发挥重要作用,基于以上的研究我们发现变应原Art v 1和Der p 1可以介导HNEp C中细胞凋亡相关信号通路和程序性坏死的正向激活,而细胞焦亡相关信号通路由于缺少KEGG和GO中的基因注释无法被富集。在对Art v 1和Der p 1处理HNEp C转录组学数据分析中我们发现IL-1β基因转录水平上升,作为细胞焦亡信号中的关键蛋白,IL-1β基因转录水平上升提示细胞焦亡途径的激活。通过实验我们进一步发现变应原Art v 1和Der p 1处理后HNEp C细胞膨大,并且有许多气泡状突出物,同时细胞中Caspase-1活化,LDH和IL-1β释放增加,表明Art v 1和Der p 1介导HNEp C发生细胞焦亡。综上,通过以上研究,我们分析了季节性与常年性AR患者鼻黏膜上皮细胞中基因表达的差异,揭示了二者生物学机制的可能差异。随后,对HNEp C中Art v 1和Der p 1的相互作用蛋白进行鉴定和富集分析,同时对致敏蛋白导致的HNEp C差异表达基因进行分析,并对细胞焦亡途径进行验证,阐明Art v 1和Der p 1通过影响HNEp C的细胞焦亡参与AR的发生发展,为蒿属花粉和HDM变应原介导的AR的发病机理的深入探究以及精准治疗奠定基础。