背景及目的孢子丝菌病（Sporotrichosis）是申克孢子丝菌及其卢里变种引起的皮肤、皮下组织、黏膜及淋巴系统的感染性疾病,偶可播散至全身引起多系统的损害。近年来孢子丝菌病发病率逐年上升,目前常用的治疗方法主要有抗真菌药物、光动力、温热疗法、冷冻和外科手术等,但效果不尽人意。随着对孢子丝菌病发病机制研究的不断深入,人们发现NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白 3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3）炎症小体可通过调节焦亡影响CD4-T细胞亚群介导的适应性免疫反应发挥抗真菌感染作用,但NLRP3在孢子丝菌病患者发病及病情进展中的作用尚不清楚。故本研究拟通过检测NLRP3在孢子丝菌病患者皮损组织中的表达情况,探讨NLRP3在孢子丝菌病发病及病情进展中的作用,为孢子丝菌病诊断、病情评估及治疗提供新的靶点。激光治疗具有高效、经济、安全、不耐药等诸多优势,是一种很有前途替代传统抗真菌治疗的新疗法。目前报道激光可以治疗甲真菌病（红色毛癣菌为主）、着色牙生菌病、白色念珠菌病、马拉色菌感染、烟曲霍感染等。不同类型激光在作用机制及使用方法上存在一定差异,其中Nd:YAG 1064 nm激光穿透性强,可以达到真皮深层的病变部位,真菌细胞壁的黑素颗粒通过选择性吸收Nd:YAG 1064nm激光产生光热效应,达到在破坏真菌的同时避免周围组织受到损伤的目的。我们团队前期工作显示Nd:YAG1064nm激光治疗孢子丝菌病有效,但治疗孢子丝菌病机制尚不清楚。故本研究拟进一步探讨Nd:YAG 1064 nm激光对孢子丝菌病的治疗作用及机制,为临床应用于孢子丝菌病的治疗提供理论依据。抗菌肽（Antimicrobial peptides,AMPs）是一种广泛存在于自然界生物体中的小肽类物质,具有广谱性、相对分子质量小、高效性、稳定性、选择毒性及不易产生抗药性等优点,对多种病原微生物具有杀伤作用。既往研究表明,蝎毒衍生的抗菌肽ToAP2（AP02759）有抗白色念珠菌活性强、溶血性与细胞毒性低、抗真菌生物膜活性显著等优点,具备新型抗菌药物开发的巨大潜力。由于孢子丝菌与白色念珠菌均属双相真菌,生物学特性相似,故本研究拟以抗菌肽ToAP2结构为模板,进行分子改造,研究改造后的衍生肽通过点阵激光辅助给药对孢子丝菌病的治疗作用及机制,为临床治疗孢子丝菌病提供一种新方法。方法1.选取60例孢子丝菌病患者皮损组织及30例健康人皮肤组织,孢子丝菌病患者分为急性组（≤3个月）和非急性组（＞3个月）,每组30例。采用免疫组织化学方法检测皮损组织NLRP3的表达情况,并分析NLRP3与病情进展的关系。2.通过体外实验和体内实验探讨Nd:YAG 1064 nm激光对孢子丝菌病的治疗作用及机制。（1）体外实验将分离培养的孢子丝菌接种于脑心固体培养基,通过细胞活性（C CK-8）实验确定Nd:YAG 1064nm激光对孢子丝菌的最佳照射参数;通过扫描电镜观察Nd:YAG 1064 nm激光对孢子丝菌形态的影响;通过激光扫描共聚焦显微镜观察Nd:YAG 1064nm激光照射后孢子丝菌的凋亡及坏死（Hoechst;PI双染）情况;釆用氧化应激实验检测Nd:YAG 1064 nm激光照射后孢子丝菌H2O2和SDS敏感性变化;采用荧光分光光度计法检测Nd:YAG 1064 nm激光照射后孢子丝菌ROS累积水平及线粒体膜电位水平变化;通过激光扫描共聚焦显微镜观察Nd:YAG 1064nm激光照射后孢子丝菌metacaspase活性变化。（2）体内实验构建BAIB/c小鼠局限性皮肤型孢子丝菌病动物模型,通过组织病理学证实模型构建成功。分为感染组、激光组及伊曲康唑组。①感染组:既不给予Nd:YAG 1064 nm激光照射,亦不给予药物治疗;②激光组:给予Nd:YAG 1064 nm激光7天照射1次,能量密度100 J/cm2,脉宽30ms,频率1Hz;③伊曲康唑组:每日给予60mg/kg伊曲康唑灌胃治疗。对照组为同龄健康鼠。采用PhotoshopCC2019软件每日计算各组小鼠足垫面积。实验第14天、22天及30天,通过免疫组织化学染色比较各组小鼠足垫组织NLRP3、caspase-1及caspase-3表达情况。通过ELISA检测各组小鼠血清细胞因子IFN-γ、IL-17及TGF-β 1表达水平。3.采用截取有效片段联合氨基酸替代法设计改造蝎毒衍生的抗菌肽ToAP2,并应用生物信息学软件对它们的理化性质进行筛选和分析。采用固相合成法合成抗菌肽ToAP2的衍生肽ToAP2A、ToAP2C、ToAP2D,通过纸片抑菌法筛选出抗菌活性最强的衍生肽进行体外实验及体内实验。（1）体外实验将分离培养的孢子丝菌接种于脑心固体培养基,24h后,实验组均匀涂布抗菌活性最强的衍生肽（4m g/mL）,对照组加入等量生理盐水。采用扫描电镜观察衍生肽对孢子丝菌形态的影响;通过激光扫描共聚焦显微镜观察衍生肽对孢子丝菌凋亡及坏死（Hoechst/PI双染）的影响;采用流式细胞仪检测衍生肽对孢子丝菌ROS累积水平、线粒体膜电位水平及metacaspase活性的影响。（2）体内实验构建BALB/c小鼠局限性皮肤型孢子丝菌病动物模型,通过组织病理学证实模型构建成功。分成感染组、点阵组、衍生肽联合点阵组（以下简称联合组）及伊曲康唑组。①感染组:小鼠既不给予CO2点阵激光照射,亦不给予衍生肽治疗;②点阵组:给予CO2点阵激光3天照射1次,能量密度为120 mJ/mm2,覆盖率25.0%;③联合组:激光照射同点阵组,每日给予4m g/ml衍生肽溶液外用治疗;④伊曲康唑组:每日给予60mg/kg伊曲康唑灌胃治疗。对照组为同龄健康鼠。采用PhotoshopCC2019软件每4日计算各组小鼠足垫面积。通过HE染色及免疫组织化学染色比较各组小鼠足垫组织炎症细胞浸润和caspase-3表达情况。结果1.孢子丝菌病患者皮损组织NLRP3表达显著高于正常人皮肤组织（P＜0.001）;NLRP3的表达水平与患者性别、年龄无关（P＞0.05）,但与病程有关,急性期患者皮损组织NLRP3表达水平显著高于非急性期（P＜0.001）。2.Nd:YAG 1064 nm激光对孢子丝菌病的治疗作用及机制（1）体外实验C CK-8实验结果显示Nd:YAG 1064 nm激光可有效抑制球形孢子丝菌生长,最适照射能量密度为400J/cm2（孢子丝菌吸收的实际能量密度为191 J/cm2）。扫描电镜观察Nd:YAG 1064nm激光可以使孢子丝菌菌体发生皱缩、细胞破坏、内容物泄出。激光扫描共聚焦显微镜Hoechst/PI双染实验显示Nd:YAG 1064 nm激光可诱导孢子丝菌凋亡及坏死。氧化应激实验显示Nd:YAG 1064nm激光可引起孢子丝菌对H2O2和SDS的敏感性升高。荧光分光光度计法检测线粒体膜电位荧光比值,激光组为9.9%±1.4%,对照组为100%,激光组孢子丝菌线粒体膜电位水平明显低于对照组（P＜0.001）;ROS积累水平激光组为43.7%±7.8%,对照组为3.5%±1.3%,激光组孢子丝菌ROS积累水平明显高于对照组（P＜0.01）;激光扫描共聚焦显微镜观察Nd:YAG 1064 nm激光引起孢子丝菌metacaspase活性明显增高。（2）体内实验1)通过组织病理证实成功构建了局限性皮肤型孢子丝菌病小鼠动物模型。2)孢子丝菌病模型小鼠足垫面积变化 实验第14天、22天,激光组、伊曲康唑组及感染组足垫面积明显大于对照组（P＜0.001）;实验第30天,感染组足垫面积仍显著大于对照组（P＜0.01）,但激光组及伊曲康唑组小鼠足垫面积与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。实验第14,22及30天,激光组及伊曲康唑组小鼠足垫面积均明显小于感染组（P＜0.01）。3)Nd:YAG 1064 nm激光治疗对孢子丝菌病小鼠模型NLRP3-Caspase-1焦亡通路及Caspase-3凋亡的影响 实验第14天,激光组小鼠足垫组织NLRP3及Caspase-1表达水平显著高于对照组（P＜0.05）,感染组Caspase-1表达水平显著高于对照组（P＜.0.01）,NLRP3表达水平与对照组比较未见显著性差异（P＞0.05）;实验第22天,感染组及激光组小鼠足垫组织NLRP3及Caspase-1表达水平均显著高于对照组（P＜0.01）;实验第30天,激光组NLRP3及Caspase-1表达水平与对照组比较无统计学差异（P＞0.05）,感染组Caspase-1表达水平与对照组比较亦无统计学差异（P＞0.05）,但NLRP3表达水平仍高于对照组（P＜0.01）。此外,实验第14天及22天激光组小鼠足垫组织Caspase-3表达水平均明显高于对照组（P＜0.05）,而感染组Caspase-3表达水平与对照组比较均无统计学差异（P＞0.05）;实验第30天,激光组及感染组Caspase-3表达水平与对照组比较均无统计学差异（P＞0.05）。4)Nd:YAG 1064 nm激光治疗对孢子丝菌病模型小鼠血清IN-γ、IL-17及TGF-β 1表达水平的影响 实验第14天,激光组小鼠血清IL-17及IFN-γ表达水平显著高于对照组（P＜0.01）;感染组IFN-γ表达水平显著高于对照组（P＜0.001）,IL-17表达水平与对照组比较未见明显差异（P＞0.05）;但激光组小鼠血清细胞因子IL-17表达水平显著高于感染组（P＜0.01）;实验第22天,激光组IL-17表达水平恢复正常（P＞0.05）,而IEN-γ表达水平仍显著高于对照组（P＜0.01）;感染组IL-17及IFN-γ表达水平均显著高于对照组（P＜0.001）,激光组IL-17及IFN-γ表达水平均明显低于感染组（P＜0.05）;实验第30天,激光组及感染组IL-17和IFN-γ表达水平与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）,但激光组IL-17表达水平明显低于感染组（P＜0.001）。实验第14天,激光组及感染组TGF-β1表达水平与对照组比较均无统计学差异（P＞0.05）,且激光组TGF-β 1表达水平与感染组比较亦无统计学差异（P＞0.05）;实验第22天,激光组及感染组TGF-β1表达水平均明显低于对照组（P＜0.005）,但激光组TGF-β1表达水平与感染组比较无统计学差异（P＞0.05）;实验第30天,激光组及感染组TGF-β 1表达水平与对照组比较均无统计学差异（P.＞0.05）,但激光组TGF-β1表达水平明显低于感染组（P＜0.05）。5)NLRP3/Caspase-1 与 IL-17/FN-γ 相关性分析 激光组 NLRP3 与Caspase-1 表达水平呈正相关（r=0.580,P=0.012）,且 NLRP3 和 caspase-1 表达水平与 IL-17（r=0.519,P=0.027;r=0.627,P=0.005）和 IFN-γ（r=0.624,P=0.006;r=0.876,P=0.000）分别呈正相关。3.改造筛选后的3条衍生肽ToAP2A、ToAP2C、ToAP2D,二级结构以α螺旋为主;改造后的衍生肽与母肽相比肽链长度明显缩短,分子量及不稳定系数均降低,脂溶性指数、亲水性指数及蛋白结合能力升高;采用固相合成法合成的3条衍生肽纯度大于95%,均能抑制孢子丝菌生长,其中ToAP2D抑菌活性最强,其 MIC 值为 156.25 μg/mL。（1）体外实验 扫描电镜观察衍生肽ToAP2D可使球形孢子丝菌菌体发生皱缩、细胞破坏、内容物泄出。激光扫描共聚焦显微镜Hoechst/PI双染实验显示衍生肽ToAP2D可诱导球形孢子丝菌凋亡及坏死。流式细胞术检测ROS积累水平,衍生肽ToAP2D组为40.84%±5.69%,对照组为4.6%±1.00%,衍生肽组ROS积累水平明显高于对照组（P＜0.01）;线粒体膜电位荧光比值,衍生肽ToAP2D组为4.30±1.29,对照组为26.73±8.58,衍生肽ToAP2D组线粒体膜电位水平明显低于对照组（P＜0.01）;metacspase水平衍生肽ToAP2D组为62.05%±4.15%,对照组为 2 0.73%±3.05%,衍生肽 ToAP2D组 metacaspase 水平明显高于对照组（P＜0.001）。（2）体内实验1)通过组织病理证实成功构建了局限性皮肤型孢子丝菌病小鼠动物模型。2)孢子丝菌病模型小鼠足垫面积变化 实验第14天,联合组、点阵组、伊曲康唑组及感染组足垫面积明显大于对照组（P＜0.01）;实验第26天,点阵组及感染组足垫面积仍显著大于对照组（p＜0.001）,但联合组及伊曲康唑组小鼠足垫面积与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。3)炎症细胞润情况 组织病理HE染色显示,实验第18天,联合组、点阵组及感染组炎症细胞漫润明显高于对照组（P＜0.01）;实验第26天,点阵组及感染组炎症细胞浸润仍明显高于对照组（P＜.0.01）,但联合组与对照组比较无显著性差异（P＞0.05）。4)Caspase-3表达情况 免疫组化结果显示实验第18天及26天,联合组小鼠足垫组织Caspase-3表达水平明显高于对照组（P＜0.05）,点阵组及感染组Caspase-3表达水平与对照组比较未见显著性差异（P＞0.05）。结论1.NLRP3在孢子丝菌病患者皮损组织中的表达显著高于正常皮肤,且与病程有关。推测NLRP3高表达可能在孢子丝菌病的发生发展中发挥重要作用,有望成为孢子丝菌病诊断、病情评估及治疗的新靶点。2.Nd:YAG 1064nm激光对孢子丝菌病动物模型具有明显的治疗作用,Nd:YAG 1064 nm激光可有效抑制孢子丝菌生长,破坏孢子丝菌的形态结构,诱导孢子丝菌发生凋亡及坏死。其机制可能为引发线粒体膜电位下降,导致孢子丝菌ROS大量积累,激活caspase依赖的细胞凋亡途径;通过激活NLRP3-Caspase-1焦亡通路;调节小鼠Th1和Th17细胞免疫;促进Caspase-3凋亡的发生。该研究为Nd:YAG 1064 nm激光临床应用于孢子丝菌病的治疗提供了理论依据。3.成功合成了 3条抗菌肽ToAP2衍生肽ToAP2A、ToAP2C、ToAP2D,它们对孢子丝菌均具有明显的抑制作用,其中ToAP2D抗孢子丝菌活性最强,血清稳定性良好且无急性毒性反应。体外实验表明衍生肽ToAP2D能够诱导孢子丝菌发生凋亡与坏死,其机制可能与引发线粒体膜电位下降,导致孢子丝菌ROS大量积累,最终激活caspase依赖的细胞凋亡途径有关。体内实验结果显示衍生肽ToAP2D联合点阵激光对孢子丝菌病动物模型具有明显的治疗作用,其机制与降低足垫炎症并促进Caspase-3凋亡的发生有关。该研究为衍生肽ToAP2D临床应用于孢子丝菌病的治疗提供了理论依据,亦为临床治疗孢子丝菌病提供了一种新思路。