多数植物作为无法主动迁徙的生命形式,为应对环境不利条件,在长期进化选择过程中,建立了独特复杂的调控机制以维持正常生长需要与各种胁迫之间的微妙平衡。当今全球气候变暖,温室效应加剧,高温成为影响植物正常生长发育的重要因素之一。高温会诱导植物蛋白质发生变性和错误折叠,而热激蛋白（Heat shock protein,HSP）会在热应激（Heat stress,HS）发生时被激活,并且在维持蛋白质正常功能中发挥着重要作用。另外,自噬（Autophagy）广泛存在于真核生物中,对于维持细胞内稳态平衡具有至关重要的作用。有研究表明,自噬在热应激发生后被激活以降解蛋白质,这表明两种抗逆途径之间必定存在交叉作用,但目前在这方面的研究甚少,尤其在植物体胚中的研究仍未明确。龙眼（Dimocarpus longan Lour.）属无患子科木本植物,并且是我国重要经济果树之一。龙眼体胚发生系统的建立为研究植物胚胎发生提供了优良的模式系统。本研究拟在前人研究基础之上,以龙眼体胚作为研究对象,研究热胁迫与自噬处理对龙眼胚性愈伤组织（EC）增殖和分化的影响,并测定相关生理生化指标;同时对龙眼HSP家族进行全基因组鉴定;通过热胁迫处理与自噬促进剂（RAPA）及抑制剂（3-MA）处理龙眼EC和合子胚,从两个角度探讨其对龙眼早期体胚发生和合子胚发育的影响以及相关基因的表达分析;构建过表达载体,进行亚细胞定位分析以及稳定转化龙眼EC,分析相关基因在过表达龙眼EC系中的表达情况。以期为深入研究热胁迫与自噬在植物体胚发生中的相互作用提供新的见解。主要研究结果如下:1热胁迫与自噬处理对龙眼体胚早期的形态建成及生理生化的影响通过对龙眼EC进行不同温度处理,发现30℃和35℃热胁迫促进胚性培养物的增殖,但是抑制了龙眼早期体胚发生;利用不同浓度自噬促进剂（RAPA）及自噬抑制剂（3-MA）处理龙眼EC,发现无论促进自噬或抑制自噬,对胚性培养物增殖影响不明显,但同样抑制了龙眼早期体胚发生;利用35℃热胁迫与3-MA（或RAPA）复合处理龙眼EC,结果发现双因素处理均促进了胚性培养物的增殖,但同样抑制龙眼体胚发生,可能为叠加效应。此外,基于上述基础,改变长期处理为瞬时处理,结果发现双因素瞬时处理8 h下,在15 min-30 min极短处理时间内龙眼体胚中MDA、H2O2、SOD和POD等相关生理指标水平发生短期上调。这表明热胁迫与自噬这两个因素长期存在对于体胚发生是不利的,且在龙眼体胚发生更前期发挥作用。从生理角度为揭示热胁迫与自噬处理在龙眼体胚中的作用提供基础,对研究其它植物胚胎发育提供新的见解。2龙眼热激蛋白超家族全基因组鉴定及表达分析本研究对龙眼HSPs基因家族进行全基因组鉴定,共筛选得到225个DlHSPs家族成员,划分为HSP20、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90和HSP100六个亚族,并分别对应拥有58、89、26、26、6和20个成员。并进行蛋白质理化性质分析、基因结构分析、保守基序分析、构建系统发育进化树及启动子分析等内容,这些结果表明该超家族内部多样复杂,各亚族之间存在巨大差异,在植物发育过程中发挥不同作用。基于转录组数据,进行HSP超家族成员在龙眼体胚早期发生三个阶段（EC、ICp EC和GE）的表达模式分析,结果发现该家族不同成员在体胚发生早期不同阶段分别发挥不同作用。本研究为揭示HSP在龙眼体胚中的潜在功能提供理论基础,并助于筛选目标基因及后续深入研究。3热胁迫与自噬剂处理下龙眼HSPs和ATGs的表达模式分析基于上述研究,进一步利用自噬促进剂（RAPA）及抑制剂（3-MA）处理龙眼体胚和合子胚,探讨其对龙眼合子胚发育、内源激素以及相关基因表达的影响。结果发现,3-MA和RAPA处理同样抑制了龙眼合子胚的发育;定量分析结果表明,在龙眼体胚早期分化过程中,自噬（Dl ATG8d和Dl ATG8f）与热激蛋白相关基因（DlHSP20-7和DlHSP20-48）均保持较低水平。长期热胁迫下,这些基因无明显变化。而先促进或抑制自噬后增加热胁迫处理下,ATG8s基因发生上调,而HSPs基因无明显变化。另外,瞬时处理下,发现这些基因在30 min内响应上调,这表明它们主要作为应激基因形式存在,极短时间内响应,并且在植物体内以一定阈值水平存在,高于或低于此阈值均不利于体胚发育。总之,该研究为深入分析热激蛋白和自噬相关基因在植物胚胎和龙眼体胚中的作用提供新的思路。4龙眼DlHSP20s和Dl ATGs相关基因克隆及亚细胞定位分析本研究进一步克隆了热激蛋白基因（DlHSP20-7和DlHSP20-48）和自噬相关基因（Dl ATG8d和Dl ATG8f）的CDS序列,分别对应为741 bp、453 bp、330 bp及369 bp。同时,构建相应过表达载体,通过农杆菌转化烟草叶片及龙眼原生质体,结果发现,亚细胞定位观察结果与预测结果一致,其中DlHSP20-7属于叶绿体定位蛋白,DlHSP20-48、Dl ATG8d和Dl ATG8f均属于胞质定位蛋白,定位结果表明这些蛋白发生功能的位置主要位于细胞质,为深入了解HSP20s和ATG8s蛋白在植物中的功能作用提供基础。5龙眼自噬相关基因Dl ATG8d和Dl ATG8f的功能研究基于上述研究基础,本研究构建了p CAMBIA1301过表达融合载体,并通过农杆菌介导转化龙眼EC,结果发现,Dl ATG8d的瞬时过表达促进了Dl ATG8f和热激蛋白相关基因（DlHSP20-7和DlHSP20-48）的上调。另外,过表达Dl ATG8f后促进了Dl ATG8的表达,DlHSP20-7和DlHSP20-48无明显变化。同时,为研究ATG8在龙眼中的功能,将Dl ATG8d稳定转化龙眼EC,对相关基因进行表达分析,结果表明,过表达Dl ATG8d后,使得Dl ATG8f、DlHSP20-7和DlHSP20-48基因下调表达,这表明Dl ATG8d与另三个基因之间存在负调控关系。此外,将过表达ATG8d龙眼细胞系接种至MS基本培养基上,探究过表达该基因后对龙眼体胚分化的影响,结果表明,过表达ATG8d抑制了龙眼体胚分化。总之,本研究为后续进一步分析ATG和HSP之间的互作关系提供新的理论参考。综上所述,本研究发现热胁迫、自噬促进或抑制剂处理单因素处理下均抑制龙眼体胚发生,但可以促进细胞增殖;双因素（热胁迫与自噬处理）同样抑制龙眼体胚发生,同样可以促进增殖,推测可能是由于热激在促进细胞增殖发挥主要作用;在龙眼体胚和合子胚中的研究表明HSPs基因和ATGs基因在短期发生响应,推测这些基因在短时间内发生响应,随后恢复至正常水平;过表达ATGs基因后,瞬时处理结果表明ATG8d可能发挥核心作用,稳定转化结果表明自噬可能还存在负调控作用,具有“双面性”,为后续研究提供新的切入角度。