【摘 要】
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琯溪蜜柚（Citrus grandis（L.）Osbeck‘Guanximiyou’）果实由于果大皮薄、风味清香、汁囊口感细腻、营养价值高,而广为人们喜爱。但是近几年,琯溪蜜柚普遍出现了汁胞粒化现象,已经严重影响到其商品价值和经济效益。目前对汁胞粒化的研究主要集中在木质素代谢途径结构基因的功能上,而有关LIM转录因子对木质素代谢的影响研究较少,因此对柚LIM转录因子进行研究意义重大。本试验鉴定分析
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琯溪蜜柚（Citrus grandis（L.）Osbeck‘Guanximiyou’）果实由于果大皮薄、风味清香、汁囊口感细腻、营养价值高,而广为人们喜爱。但是近几年,琯溪蜜柚普遍出现了汁胞粒化现象,已经严重影响到其商品价值和经济效益。目前对汁胞粒化的研究主要集中在木质素代谢途径结构基因的功能上,而有关LIM转录因子对木质素代谢的影响研究较少,因此对柚LIM转录因子进行研究意义重大。本试验鉴定分析了柚LIM转录因子家族,并结合转录组筛选了与汁胞粒化相关的2个柚LIM基因。克隆了这2个柚LIM基因,并对其功能和作用机制进行研究。主要结果如下:1、对柚LIM转录因子进行全基因组鉴定,共得到24个CgLIM转录因子。其氨基酸数目在103～735之间,理论等电点为4.9～10.13,不稳定系数为16.56～61.23,脂肪系数为48.08～83.7,平均亲水性为-0.92～-0.271;蛋白质二级结构主要以无规则卷曲为主,其次为α螺旋。CgLIM基因主要分布在1号、3号、5号、7号、8号染色体上;外显子数量介于1～17之间;均含有1～2个LIM结构域。启动子顺式作用元件均含有光响应元件,除CgLIM22外其它均含有多种激素响应元件以及与厌氧相关的顺式作用元件。可以将24个CgLIM转录因子分为5个亚族,CgLIM1、CgLIM2、CgLIM3、CgLIM4、CgLIM5、CgLIM6、CgLIM7、CgLIM13、CgLIM19、CgLIM20、CgLIM21属于DA1＆DAR亚族,主要与植物器官发育和非生物胁迫有关;CgLIM11、CgLIM12、CgLIM23属于αLIM1亚族中WLIM1类,主要与植物木质素合成和次生壁形成有关;CgLIM15属于βLIM1亚族,具体功能未知;CgLIM8、CgLIM9、CgLIM10、CgLIM17、CgLIM18、CgLIM22、CgLIM24属于γLIM2亚族,此亚族可以参与基本的细胞过程;CgLIM14、CgLIM16属于δLIM2亚族,与花粉发育有关。综上,CgLIM11、CgLIM12、CgLIM23可能通过调控柚子木质素合成进而调控汁胞粒化的发生。2、利用转录组筛选得到2个与汁胞粒化相关的CgLIM基因,分别为CgLIM11、CgLIM23。克隆了CgLIM11、CgLIM23基因,其中CgLIM11开放阅读框为600 bp,CgLIM23开放阅读框为594 bp。生物信息学分析发现,CgLIM11、CgLIM23均含有LIM1＿SF3、LIM2＿SF3保守结构域,且为亲水蛋白,没有跨膜现象也不含信号肽。其中,CgLIM11与甜橙KAH9755808.1亲缘关系最近,CgLIM23与甜橙KAH9655638.1以及克莱门柚XP＿006422808.1亲缘关系最近。亚细胞定位试验发现均定位在细胞核上,说明CgLIM11、CgLIM23可能作为转录因子参与柚子汁胞粒化。3、CgLIM11和CgLIM23瞬时转化烟草、柚子和稳定转化拟南芥发现,CgLIM11可促进PAL、4CL、C4H、CAD在烟草、柚子和拟南芥叶片中表达,同时4CL、C4H、CAD在拟南芥茎秆中也显著上调表达;CgLIM23促进PAL和CAD在柚子和拟南芥叶片中表达,同时CAD在烟草和拟南芥茎秆中也显著上调表达,C4H还可以在拟南芥叶片和茎秆中上调表达。研究还发现,CgLIM11和CgLIM23均可以提高PAL酶的活性,CgLIM11促进瞬时转化柚子和稳定转化拟南芥的木质素含量积累,而CgLIM23可以促进瞬时转化烟草、柚子和稳定转化拟南芥的木质素含量增加。4、通过双荧光素酶试验发现CgLIM11、CgLIM23转录因子可以激活CgPAL启动子的活性。通过酵母双杂文库筛选试验,发现2个与CgLIM11的互作蛋白,分别为Cg6g018280.1、Cg9g009800.1;4个与CgLIM23互作的蛋白,分别为Cg4g003240.1、Cg1g000620.1、Cg9g025500.1、Cg6g019590.1。CgLIM11可以通过激活柚汁胞CgPAL启动子的活性直接调控木质素的合成,而CgLIM23除了通过激活CgPAL启动子的活性直接调控外,还可能通过与Cg1g000620.1、Cg6g019590.1蛋白产生互作,共同调控木质素的合成。综上所述,通过柚LIM转录因子家族和柚转录组联合分析,筛选得到2个与柚子汁胞粒化相关的转录因子CgLIM11和CgLIM23。两者均可能与PAL-box元件结合,激活CgPAL启动子的活性,促进PAL等相关基因的表达,提高PAL酶活性,增加木质素含量,最终导致柚子汁胞粒化。CgLIM23还可能与Cg1g000620.1、Cg6g019590.1互作,共同调控柚子汁胞粒化。
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