研究背景:心肌梗塞等缺血性心胜疾病是导致全球死亡率和发病率的主要因素。心肌梗塞造成组织的局部缺血会引发心肌病，包括心肌收缩功能紊乱，纤维化疤痕的形成和心肌结构的重塑。心胜重构反应不仅发生在梗死心肌层，还会引起梗死远端区异常的病理性心肌那大并停随能量代谢的重构如降低脂肪酸代讲增加糖醉解反应。代谢的重构导致ATP的含量减少，加速了损伤心脏到心脏衰蝎发生的进程。调控心脏能量代谢的稳态是阻止缺血性心胜有害重构的有效治疗方法，但是长链非编码RNA在能量调控中的作用研究的非常少，我们通过心梗后的小鼠心脏组织芯片鉴定到一个下调最显著的新的心肌细胞富集的LncRNA，命名为LncHri能够调控导致心胜衰竭的代谢和病理生理学过程。研究目的:探索长链非编码RNALncHrt在心胜稳态中的作用及心梗后对能量代谢调控和心非功能保源中的作里，并来容Hr对的胜能，你这稳本的调掉机制。研究方法:通过结扎小鼠心胜冠脉系统的左前降支构建小鼠心梗模型，用基因芯片的方法饰选出心棰3天和14天洪同下调的最显著的LncRNA，并通过差异基因表达。组织分布和LncRNA在心胜组织中的表达丰度量终籍选到心梗后下调是显著的特导高表达在心脏中的LncRNA命名为LncHri。用荧光定量PCR的方法研究LncHr在整个心班发育过程中的基因表达谱，心脏细胞类群中的分布和亚细胞定位。用5和3’cDNA末嫌快速克隆的方法从小鼠心脏的RNA中克隆得到IncHrt的全长，用UcsC Genome Browser（GRiCm38/mm10）分析LncHn物种问的保守性，用RegRNAServer预测LncHrr的二级结构。并在扩张性心肌病病人组织中检测到人同源的LncHrt表达模式与小鼠心梗模型表达一致，均显著下调。通过AAV9介导的方式乳小鼠皮下注射LncHn的shRNA心班特异抑制LncHrt的表达，研究LncHrt在心脏稳态中的调控作用。通过AAV9介导的方式乳小鼠皮下注射LmcHr心肌细胞特异高表达LncHri，研究过表达LucHrt对心梗后心脏的能量调控和心脏功能的保护作用。Sinusred和fastareen染色定量心胜纤维化和心肌梗死面积。用无偏差的RNA-seq探索LncHrt介果的心梗后的心脏保护作用的分子机制，用Database for Annotation and Visualization and Integrated Discovery（DAVID）工具对差异表达基因进行功能注释，Gene Set Enrichment Analvsis（GSEA）进一步比较分析sham和心梗心脏结合有或无LncHr过表达的心梗心胜的转录组测序数据研究LncHrt在心班代谢中的调控作用。用substrate-uncoupler-inhibitor-titration（SUIT）方法测定了梗死远端区透化的小鼠心脏肌纤维的氧耗速率来检测线粒体的呼吸，通过测定在偶联状态下ADP调节的氧气流量来评价线粒体的功能。通过RNA pulldown实验结合质谱分析鉴定LncHrt相互作用的蛋白SIRT2。用RNA免疫共沉淀的实验证明IncHrt与SIRT2的内源性相互作用。蛋白印记方法检测LncHr调控的信号通路的活性，免疫共沉淀实验验证LncHrt相互作用蛋白SIRT2与其上游调控蛋白CDK5的相互作用。免疫沉淀实验检测SIRT2下游激酶LKB1的乙酰化修饰。研究结果:第一部分;长链非编码RNA的筛选1.长链非编码RNá的筛选通过基因芯片分析心梗3天和14天下调最显著的长链非编码RNA，并通过半定量逆转录聚合酶链反应（RT-aPCR）验证得到一个心脏特异高表达。心肌细胸高表达，在细胞质和细胞核中均有表达的LncRNA，命名为LncHn。LucHr在整个心班发育过程中从出生7天后急剧增加一直持续到成年阶段并在21天的表达量达到最高值，提示EmcHrr是维持成年心脏稳态所必需的，可能与营养底物的代谢相关。2长链非编码RNALncHn的克隆和验证我们用5’和3’cDNA末端快速克隆的方法克隆得到LncHrr的全长，用Coding Potential Calculator来评估LcHrt编码蛋白的能力，LncHr与已知的LncRNAChaer和Hotair类似,具有非常低的蛋白编码能力。表明LmcHrt是一个长链非编码RNA。3、长链非编码RNALncHin的保守性及在扩张性心肌病人中的表达。LncHrt在人的基因组中也定位于14号染色体，小鼠LncHrt的1号外显子和2号外星子的5和3:端序列在多个物种中高度保守。用Reg RNA Server预LncHr的二级结构显示LncHrt含有颈环结构，并具有相对高的base-pairing能力。我们进一步检测人同源的JncHrr在扩张性心肌病病人心胜组织中的表达情况。与小鼠心硬模型中的表达下调类似，人同源的LmcHrr在扩张性心肌病病人中表达急剧降低，提示Lnélir在调控心脏疾病中的重要作用。第二部分:AAV9介导的心胜特异敲降LncHrt损伤心脏稳态1.为了明确LncHri在心脏中的功能，我们给刚出生的乳小鼠注射靶向LncHrr的AAV9-shRNA，在心驻中特异抑制LncHrt的表达。与对照组相比，LncHrt敲降组小虽心脏显著增大，并伴随着心脏重量/体重（HW/BW）显著增加，心胜超声显示LncHri基因敲降组心脏收缩功能显著受损，射血分数（FS）减少，室壁厚度（LVPW）变薄，左心室心腔扩张（LVID）。2.在组织学水平，观察到大量的胶原沉积，提示抑制LncHrt表达引发心脏的纤维化。我们进一步用WGA免疫荧光染色定量乳头肌上的心肌细胞面积，AAVLncHrtKD组心肌细胞面积显著变大，提示敲降LmcHr引起心肌细胞病理性肥大。在分子水平，qPCR检测心肌肥大相关的marker基因Nppa，Nppb,Myh7均显著增加，进一步证明敲降LmcHrt诱发心脏的病理性肥大。第三部分:过表达LncHrt保护心梗后的心脏功能1.我们用AAV9系统联合cTNT启动子介导LmcHrr心肌细胞特异过表达，并构建心梗模型。过表达LncHrt组的小鼠心脏重构明显得到缓解，小鼠心梗后的心脏明显比对照组的小，并伴随着心脏重量/体重（HW/BW）显著降低。小鼠心梗后的心脏功能与对照组比最著改善，心脏超声最示LncHirt高表达组的小鼠心脏射血分数显著增加，室壁厚度得以保持，心腔内径减小。2、组织水平siriusred和fastereen染色定量心肌梗死面积发现，过表达LmcHri显著降低心肌梗死面积和梗死远端区的心肌细胞大小。分子水平心脏肥大marke基因的表达下降近一步证实过表达LncHr级解了心梗后心脏的有害重构过程。保护心梗后的心脏功能。第四部分:LncHrt过表达救助呼死心胜的转录组1.心梗7天的LncHr过表达组和对照组的心脏组织的RNA-seq分析证实了LncHr促进代谢相关的生物学过程和“cardiacmusclecontraction”，抑制了“immunesvstemprocessinflammatoryresponse”和"collagenfbrilorzanization”等生物学过程。2.通过比较分析了sham组和心梗心脏结合有或无LncHrt过表达的心梗心脏的转录组测序数据。GeneSetEnrichmentAnalysis（GSEA）进一步证实心梗后过表达LncHrt能够完全恢复心梗下调的代谢通路“axidativephosphorylation"“fattyacicmetabolism”和“glvcolvsis”而抑制促进心梗病理学进程相关的通路“ECM receptorin teraction"和“TGF beta signaling pathway"同时促进心梗后心脏的“cardiac musclecon traction"通路。GSEA分析证实了LncHrt在调控心梗后的心脏代谢组学和muscle contraction中的重要作用。3、用荧光定量PCR验证代谢相关的差异表达基因。"carbon metabolism”“TCA cycle fatty acid metabolism”“glycolysis"fattyaciddegradation”"pyruvatemetabolism”代谢通路中的关键基因在LncHrt组均发生一致的增加。对比而盲。敲降LncHrr则抑制了代谢通路中关键基因的表达。综上，LncHri通过促进代谢相关基因的表达，增加cardiacmusclecontraction，抑制心脏纤维化的过程。改善心梗后的心脏功能。第五部分:LncHIn改善心梗后的心脏代谢稳态1.LmcHrt促进梗死远端区心脏中完好心肌的脂肪酸氧化，线粒体氧化磷酸化的复合物I，线粒体复合物Ⅱ和复合物VI的氧耗能力及ATP的产能。2.LncHrt促进梗死区缺氧条件下糖酵解途径的关键代谢酶HK1，PGK1，CS和IDH2的表达示，tncHrr促进子心梗后缺氧状态下的·TCA循环和线粒体氧化过程中的葡萄糖的利用。3.敲降LncHrt损伤了心脏的代谢稳态，敲降LncHrt抑制了线粒体的呼吸，脂肪酸代谢和氧化磷酸化过程。第六部分:LncHrt通过与SIRT2相互作用激活LKB1-AMPK信号通路1.IncHrt不通过cis调控其邻近基因KIh133的表达。我们分别在体内和体外过表达LncHm，gRT-PCR检测发现体内过表达LncHr在心梗前和心校后对KIh33的基因表达均没有影响，并且在心肌细胞过表达LncHin也不影响KM/33基因的表达。2.LmcHrt通过与SIRT2相互作用激活LKB1-AMPK信号通路。RNApulldown实验联合质谱鉴定IncHrt相互作用的蛋白Sirt2。用RNA免痉共沉淀的实验证明LmcHrt与SIRT2的内源性相互作用。LncHr与SIRT2相互作用激活SIRT2下游的LKB1-AMPK信号通路。第七部分:LncHrt通过阻断CDK5对SIRT2的抑制作用保护SIRT2的活性1.LncHrt不影响SIRT2的mRNA或蛋白表达。不管是过表达还是敲降LmcHri都不影响SIRT2的基因转录和蛋白的表达。2.LncHrt心脏代谢的保护作用通过干扰CDK5对SIRT2活性的抑制，保护SIRT2去乙酰化酶活性，促进SIRT2下游的LKB1-AMPK信号通路的激活。结论:我们鉴定到一个新的心肌细胞富集的LncRNA命名为LncHri，LncHr在局部缺血性心脏疾病中表达量显著降低。我们通过抑制LncHrr的表达发现LucHrr是维持心胜功能稳态的重要分子。在心梗后过表达LmcHrt维持心胜能量代谢稳态，改善心梗后的心脏功能。机制上，LncHrt与SIRT2相互作用，干扰CDK5对SIRT2的抑制作用，保护SIRT2去乙酰化酶活性。进而激活SIRT2下游的LKB1-AMPK信号通路减缓了心梗后心脏的有害重构。