胆碱是动物必需的维生素,本实验室前期研究发现饲粮胆碱可以提高生长中期草鱼生长性能,提高幼建鲤肠道消化吸收能力。然而关于胆碱对幼草鱼生长性能,消化吸收能力,肠道免疫功能的影响未见研究报道。本研究首先通过生长试验考察胆碱对幼草鱼生长性能、胆碱在肠道转运代谢、消化吸收能力和游离氨基酸含量及转运的影响,并确定幼草鱼的胆碱需要量,探索了胆碱对幼草鱼生长性能和消化吸收能力的影响及可能机制;第二,通过建立嗜水气单胞菌攻毒模型,研究胆碱对幼草鱼肠道免疫功能以及相关信号分子的影响;第三,通过体外信号阻断试验,研究胆碱在草鱼肠道上皮细胞的代谢途径及JAK/STAT3信号对胆碱调控草鱼肠道上皮细胞炎症因子表达的影响,揭示胆碱对幼草鱼肠道免疫功能的调控机制;第四,通过体外信号阻断试验,研究胆碱在草鱼肠道巨噬细胞的代谢途径及其对草鱼肠道巨噬细胞免疫功能的影响,进一步揭示了胆碱调控草鱼肠道免疫功能作用机制。1.胆碱对幼草鱼生长和消化吸收能力的影响试验1:选取1440尾健康草鱼（9.29±0.02 g）,随机分为6个处理,每个处理6个重复,每个重复40尾鱼。饲喂6种含不同胆碱水平的饲粮（0、400、800、1200、1600和2000 mg/kg）,胆碱的实测值分别为142.2、407.4、821.6、1215.8、1589.3和1996.6 mg/kg。饲喂70天考察胆碱对幼草鱼生长性能,胆碱转运代谢,消化吸收能力以及脂质代谢的影响。1.1胆碱对幼草鱼生产性能和胆碱转运代谢的影响结果表明:1)饲粮胆碱可以提高幼草鱼的生长性能;提高了肠道中胆碱、磷脂酰胆碱（PC）、甜菜碱和乙酰胆碱（Ach,不包括后肠）的含量（P＜0.05）,饲粮胆碱只上调高亲和胆碱转运蛋白CHT1在中肠的表达（P＜0.05）,提高了胆碱样转运蛋白如CTL1、CTL2、CTL4（不包括后肠）和CTL5在各肠段的表达（P＜0.05）;2)饲粮胆碱显著降低肝胰脏总胆固醇（TG）和甘油三酯（TC）含量,而增加血清中TG和TC含量（P＜0.05）;3)以增重率（PWG）和饲料效率（FE）为指标,确定幼草鱼（9.29-108.97g）对胆碱的需要量分别为1330.7和1283.4 mg/kg。1.2胆碱对幼草鱼消化吸收能力的影响结果表明:1)饲粮胆碱可以提高草鱼肠道消化酶（淀粉酶、胰蛋白酶和脂肪酶）和刷状缘酶（碱性磷酸酶、γ-谷酰胺转酞酶、肌酸激酶和Na+/K+-ATP酶）活力（P＜0.05）;2)缓解由于胆碱缺乏造成的杯状细胞增生,增强草鱼肠道氨基酸的吸收能力,但不同肠段中胆碱对氨基酸吸收能力和调控机制不同:（1）胆碱可以促进幼草鱼前、中、后三个肠段游离中性氨基酸（Met、Trp、Thr、Ile、Leu、Val、Gly、Pro、Ser、Cys和Tau）的吸收（P＜0.05）,这部分归因于胆碱促进了相应的氨基酸转运载体[SLC7A7、SLC7A6、SLC1A5、SLC7A9（除了中肠）、SLC7A8、SLC6A6、SLC6A19b、SLC38A2（除了前肠）]和小肽转运蛋白1（SLC15A1）的m RNA水平,同时提高了SLC1A5的蛋白水平（P＜0.05）;（2）饲粮胆碱增加了三个肠段碱性氨基酸（Lys和Arg）以及前、中肠His含量（P＜0.05）,上调了阳离子氨基酸转运载体SLC7A1和SLC15A1m RNA水平,同时提高了SLC7A1的蛋白水平（P＜0.05）;（3）饲粮胆碱增加了三个段肠内酸性氨基酸（Glu和Asp）含量（P＜0.05）,上调了酸性氨基酸转运蛋白SLC1A2a的m RNA水平（P＜0.05）;3)饲粮胆碱增加了草鱼肠道TOR（雷帕霉素靶蛋白）信号分子m RNA和蛋白水平（P＜0.05）。以上结果表明,饲粮适宜水平的胆碱提高了幼草鱼肠道消化吸收能力,这可能与其提高肠道游离氨基酸含量,上调氨基酸转运体的表达有关。2.胆碱对幼草鱼肠道免疫功能的影响试验1研究发现,适宜水平的胆碱促进幼草鱼生长并提高其消化吸收能力。肠道不仅是鱼类的消化器官,还是最大的黏膜免疫器官,其消化吸收能力可能与其肠道免疫功能相关。为进一步研究胆碱对幼草鱼肠道免疫屏障功能的影响,在试验一的生长试验结束进行了6天嗜水气单胞菌攻毒试验（试验二）,每个处理选取42尾接近平均体重的草鱼,腹腔注射2.1×10~6 CFU/ml嗜水气单胞菌1ml,通过考察胆碱对幼草鱼肠道免疫功能的影响。结果显示:1)饲粮胆碱显著提高幼草鱼肠炎抵抗能力,缓解前、中、后肠杯状细胞增生以及中、后肠出血和炎症细胞浸润;2)饲粮胆碱显著提高幼草鱼前、中、后肠溶菌酶（LZ）和酸性磷酸酶（ACP）活性,以及Ig M、补体C3和C4（除前肠外）含量（P＜0.05）;提高幼草鱼三个肠段β-defedin-1（除前肠）、hepcidin、LEAP2B、musin2和CSF-1R的m RNA水平（P＜0.05）;显著下调促炎因子IL-8（除前肠）、IL-6、IL-1β、IL-12p40（除前肠）和TNF-α（除前肠）的m RNA水平（P＜0.05）,显著上调抗炎因子TFG-β1、IL-10和IL-4/13B的m RNA水平（P＜0.05）,提高幼草鱼肠道免疫功能;3)胆碱显著上调幼草鱼三个肠段信号分子JAK1（不包括前肠和中肠）、JAK2、TYK2（不包括前肠）、STAT3b1和STAT3b2的m RNA水平（P＜0.05）,下调后肠中JAK3的m RNA水平（P＜0.05）,同时显著提高三个肠段P-STAT3S727（除前肠）和P-STAT3Y705蛋白磷酸化水平（P＜0.05）。试验二的结果表明,饲粮胆碱提高了幼草鱼肠道免疫功能,这可能与其通过JAK/STAT3信号通路调控肠道免疫功能有关。以肠炎发病率为指标,确定幼草鱼（9.29-108.97g）对胆碱的适宜添加量为1581.1 mg/kg。3.胆碱对草鱼肠道上皮细胞免疫功能的调控及机制试验2研究表明胆碱可以增强草鱼肠道免疫功能,与JAK/STAT3信号通路有关。为进一步探索胆碱调控草鱼肠道免疫功能的机制,设计试验3,以肠道上皮细胞（IECs）为研究模型,开展如下4个细胞试验:3.1胆碱对草鱼肠道上皮细胞免疫功能的影响试验3.1共设计3个处理,分别为未添加胆碱组（Without choline）、脂多糖组（LPS）以及脂多糖和胆碱组（LPS+Choline）,每个处理6个重复。在LPS模型中加入胆碱可显著上调IECs中JAK1和JAK2的m RNA水平（P＜0.05）,对JAK3、TYK2、STAT3a、STAT3b1和STAT3b2的m RNA水平没有影响（P＞0.05）;显著提高P-JAK1Y1022/1023和P-JAK2Y1002的磷酸化水平（P＜0.05）,对P-JAK3 Y1002和P-TYK2 Y1054磷酸化水平没有影响;胆碱可以提高IECs核内P-STAT3Y705磷酸化水平,对细胞核内和线粒体内的p-STAT3S727磷酸化水平没有影响。以上结果表明,胆碱提高IECs免疫功能可能通过JAK1、JAK2/STAT3对炎症因子的调控。3.2胆碱通过JAK信号分子提高草鱼肠上皮细胞免疫功能试验3.1发现,胆碱对IECs的免疫功能调控可能通过JAK1、JAK2/STAT3信号通路,为进一步探明胆碱对IECs免疫功能的调控是否通过JAK1和JAK2,在LPS炎症模型的基础上,开展试验3.2,分别进行JAK1和JAK2的基因沉默,试验共设计5个处理,分别为LPS,LPS+si JAK1,LPS+si JAK2,LPS+si JAK1+Choline和LPS+si JAK2+Choline,每个处理6个重复。结果显示:在LPS模型中加入胆碱对不同的炎症因子调控存在差异,胆碱通过JAK1和JAK2共同下调促炎因子（IL-8、IL-6、TNF-α和IL-1β）的m RNA水平（P＜0.05）,上调抗炎因子IL-10和TGF-β1的m RNA水平（P＜0.01）,胆碱下调IL-12P40 m RNA水平通过JAK1,不通过JAK2。胆碱通过JAK1和JAK2共同上调细胞核中P-STAT3Y705磷酸化水平（P＜0.01）。以上结果表明,在LPS模型中胆碱通过JAK1,JAK2/STAT3调控草鱼IECs炎症因子m RNA水平。3.3胆碱在草鱼肠上皮细胞中的转运和利用试验3.2的研究结果发现,胆碱对IECs的免疫功能调控通过JAK1、JAK2/STAT3信号通路,为进一步探明胆碱对IECs免疫功能的调控机制,开展胆碱在IECs转运利用的研究（试验3.3）,试验共设计3个处理,分别为Without choline、LPS和LPS+Choline,每个处理6个重复。结果显示:在LPS诱导的炎症模型中胆碱可以上调IECs中CTL1、CTL2和CTL5（不包括CTL4和CHT1）的m RNA水平以及CTL1和CTL2的蛋白水平（P＜0.01）。胆碱上调IECs中PC的含量以及胆碱激酶α（CKα）的m RNA水平（P＜0.05）,但不影响Ach和甜菜碱的含量以及CHDH和Ch A的m RNA水平（P＞0.05）。以上结果表明,在IECs中胆碱的吸收通过胆碱转运载体（CTL1、CTL2和CTL5）,进入细胞后可能更多通过磷酸化代谢途径发挥对免疫调控功能。3.4胆碱通过磷酸化代谢途径提高草鱼肠上皮细胞免疫功能试验3.3的研究结果发现,胆碱对IECs的免疫功能调控可能通过磷酸化代谢途径,为进一步探明胆碱对IECs免疫功能的调控是否通过磷酸化途径,在LPS诱导的炎症模型沉默CKα基因,开展试验3.4,试验共设计4个处理,分别为LPS、LPS+si CKα、LPS+Choline和LPS+si CKα+Choline,每个处理6个重复。结果表明:胆碱对大部分炎症因子（TGF-β1、IL12P40、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL10）的调控通过CKα（P＜0.01）,胆碱对JAK1和JAK2 m RNA水平以及P-JAK2Y1002和P-STAT3Y705磷酸化水平的调控部分通过CKα（P＜0.01）,而对P-JAK1Y1022/1023磷酸化水平调控不通过CKα（P＞0.05）。以上结果说明,胆碱对大部分炎症因子（TGF-β1、IL12P40、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL10）以及JAK2/STAT3信号通路的调控通过磷酸化代谢途径。4.胆碱对草鱼肠道巨噬细胞免疫功能的调控及机制试验2和试验3研究结果发现,胆碱可以提高肠道免疫功能从而提高肠炎抵抗力,草鱼肠道免疫功能的提高与胆碱对IECs免疫功能调控相关。巨噬细胞是重要的免疫细胞,为继续探明具体机制,在此基础上设计试验4,共开展如下6个细胞试验:4.1草鱼肠道巨噬细胞培养鉴定细胞长势良好,经鉴定为巨噬细胞。4.2胆碱对草鱼肠道巨噬细胞免疫功能的影响试验4.2共设计3个处理Without choline、LPS和LPS+Choline,每个处理6个重复,结果显示:1)胆碱可以显著提高肠道巨噬细胞的吞噬能力和稳定线粒体嵴的形态,提高C3和C4的含量（P＜0.05）,显著下调NO和ROS的含量（P＜0.01）;下调肠道巨噬细胞中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-12p40和IL-8的m RNA水平（P＜0.01）;上调肠道巨噬细胞中IL-4/3B、TGF-β1和IL-10的m RNA水平（P＜0.05）;2)上调complex 1、2和4的活性（P＜0.05）以及线粒体融合蛋白（OPA1、Mfn1和Mfn2）m RNA水平和蛋白表达（P＜0.01）;3)显著上调肠道巨噬细胞中JAK2和TYK2的m RNA水平（P＜0.05）以及P-JAK2Y1002和P-TYK2 Y1054以及线粒体内的P-STAT3S727磷酸化水平（P＜0.01）。以上结果表明,在草鱼肠道巨噬细胞中,胆碱通过激活JAK2和TYK2调控炎症因子的表达以及线粒体STAT3S727磷酸化,进一步调控线粒体形态,上调线粒体呼吸复合物（1、2和4）活性和吞噬能力,同时降低NO和ROS的含量。4.3胆碱通过JAK信号分子提高草鱼肠道巨噬细胞免疫功能试验4.2研究结果发现,胆碱可以提高巨噬细胞免疫功能,这与JAK2、TYK2/STAT3调控炎症因子表达和线粒体功能有关。为继续探明JAK2、TYK2/STAT3的调控机制,以肠道巨噬细胞为模型,在LPS攻毒模型基础上,分别沉默JAK2和TYK2。试验4.3共设计5个处理,分别为LPS、LPS+si JAK2、LPS+si TYK2、LPS+si JAK2+Choline和LPS+si TYK2+Choline,每个处理6个重复。结果显示:在LPS模型中,分别沉默JAK2和TYK2,1)胆碱下调抗炎因子（IL-6和IL-1β）m RNA水平通过JAK2和TYK2（P＜0.01）,上调抗炎因子（IL-10、TGF-β1和IL-4/13B）m RNA水平通过JAK2和TYK2（P＜0.01）,而胆碱对TNF-α和IL-8的m RNA水平的调控通过JAK2不通过TYK2（P＞0.05）;2)胆碱下调巨噬细胞NO和ROS含量通过JAK2和TYK2（P＜0.01）,胆碱上调线粒体融合蛋白表达（OPA1、Mfn1和Mfn2）m RNA水平以及OPA1蛋白水平通过JAK2和TYK2（P＜0.01）,而上调Mfn1蛋白水平只通过JAK2不通过TYK2;胆碱对complex 1和4活性的调控通过JAK2和TYK2,而上调complex 2的活性只通过JAK2不通过TYK2（P＜0.01）;3)胆碱通过JAK2和TYK2共同上调线粒体中P-STAT3S727磷酸化水平（P＜0.01）。以上结果说明,胆碱通过TYK2和JAK2信号分子调控肠道巨噬细胞免疫功能。4.4胆碱在草鱼肠道巨噬细胞中的转运和利用通过试验4.3的研究结果发现,胆碱对肠道巨噬细胞的免疫功能调控通过JAK2、TYK2/STAT3信号通路,为进一步探明其机制,试验4.4共设计3个处理,分别为Without choline、LPS和LPS+Choline,每个处理6个重复。结果表明:胆碱上调肠道巨噬细胞CTL1和CTL2的m RNA水平和蛋白水平（P＜0.05）。胆碱上调肠道巨噬细胞PC和甜菜碱的含量（P＜0.01）,但对Ach的含量没有影响。同时,胆碱可以上调肠道上皮细胞CKα的m RNA水平,但对CHDH和Ch A的m RNA水平没有影响（P＞0.05）。以上结果说明,肠道巨噬细胞中胆碱的吸收通过胆碱转运载体（CTL1和CTL2）,胆碱进入肠道巨噬细胞后可能通过磷酸化和氧化代谢途径发挥对免疫功能的调控。4.5胆碱通过磷酸代谢化途径提高草鱼肠道巨噬细胞免疫功能通过试验4.4的研究结果发现,胆碱对肠道巨噬细胞的免疫功能调控可能通过磷酸化代谢途径发挥作用,为进一步探明其机制,在LPS诱导的炎症模型沉默CKα,试验4.5共设计4个处理,分别为LPS、LPS+si CKα、LPS+Choline和LPS+si CKα+Choline,每个处理6个重复。结果表明:1)胆碱下调促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-8m RNA水平通过CKα（P＜0.01）,上调抗炎因子TGF-β1和IL-4/13B m RNA水平通过CKα（P＜0.01）,而胆碱上调IL-10 m RNA水平不通过CKα（P＞0.05）;2)胆碱降低NO和ROS含量通过CKα（P＜0.01）,而提高complex 2和4的活性通过CKα（P＜0.01）,而complex 2不通过CKα（P＞0.05）。此外,胆碱上调OPA1和Mfn1的m RNA以及蛋白水平的调控通过CKα（P＜0.01）;3)胆碱上调JAK2、TYK2、STAT3b1和STAT3b2 m RNA水平的调控通过CKα（P＜0.01）胆碱上调P-JAK2 Y1002以及线粒体P-STAT3S727磷酸化水平通过CKα（P＜0.01）。以上结果说明,胆碱对肠道巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-1β、TGF-β1、IL-8、IL-4/13B和TNF-α（不包括IL-10）的调控与磷酸化代谢途径激活JAK2（而不是TYK2）有关。胆碱通过磷酸化代谢途径激活JAK2调控ROS、NO、OPA1、Mfn1、complex 2和4可能与巨噬细胞线粒体P-STAT3S727有关。4.6胆碱通过氧化代谢途径提高草鱼肠道巨噬细胞免疫功能通过试验4.4的研究结果发现,胆碱对肠道巨噬细胞的免疫功能调控通过氧化代谢途径发挥作用,为进一步探明其机制,在LPS诱导的炎症模型沉默CHDH。试验4.6共设计4个处理LPS、LPS+si CHCD、LPS+Choline和LPS+si CHCD+Choline每个处理6个重复。结果表明:1)胆碱下调IL-6、IL-1β和IL-8 m RNA水平通过CHCD（P＜0.01）,上调IL-10和IL-4/13B m RNA水平通过CHCD（P＜0.01）。而胆碱对TNF-α和TGF-β1m RNA水平的调控不通过CHCD;2)胆碱下调ROS含量通过CHCD（P＜0.01）,而下调NO的含量不通过CHCD（P＞0.05）;胆碱上调complex 2和4的活性通过CHCD（P＜0.01）;上调OPA1和Mfn1 m RNA和蛋白水平的调控通过CHCD（P＜0.01）;3)胆碱上调TYK2和STAT3a m RNA水平,P-JAK2 Y1002和P-TYK2Y1052以及线粒体中P-STAT3S727磷酸化水平通过CHCD（P＜0.01）。以上结果说明,胆碱对肠道巨噬细胞炎症因子IL-6、IL-1β、IL-10、IL-8和IL-4/13B（不包括TGF-β1和TNF-α）的调控通过氧化代谢途径对JAK2和TYK2的激活。胆碱通过氧化代谢途径激活JAK2和TYK2调控ROS（不包括NO）、OPA1、Mfn1、complex1、2和4可能与巨噬细胞线粒体P-STAT3S727有关。综上所述,胆碱提高了幼草鱼生长与肠道消化吸收能力可能与胆碱促进TOR信号途径上调氨基酸含量和小肽转运载体基因表达有关;饲粮胆碱增强幼草鱼肠炎抵抗能力与其通过JAK/STAT3信号途径增强肠道免疫功能有关,但胆碱对肠道上皮细胞和巨噬细胞的免疫调控存在差异,胆碱对肠道上皮细胞免疫功能的调控通过磷酸化代谢途径仅激活JAK2调控炎症因子的表达与P-STAT3Y705核转位有关。而胆碱对肠道巨噬细胞的免疫调控通过磷酸化和氧化代谢途径,磷酸化途径只通过激活JAK2调控炎症因子的表达（不包括IL-10m RNA水平）但不影响P-STAT3Y705核转位,其对线粒体功能（不包括线粒体呼吸复合物1）的调控与线粒体P-STAT3S727磷酸化水有关,氧化途径通过JAK2和TYK2共同调控炎症因子的表达（不影响TGF-β1 m RNA水平）但不影响P-STAT3Y705核转位,其对线粒体功能（不影响NO含量）的调控与线粒体P-STAT3S727磷酸化有关。