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猪轮状病毒（Porcine Rotavirus,PoRV）是引起猪病毒性腹泻的重要病原。轮状病毒感染具有明显的肠嗜性,因此肠道黏膜免疫是抵抗病原入侵的首要防线,基于此,本项研究利用肠道益生性乳酸菌作为活菌载体,表达和传递猪轮状病毒保护性抗原VP4,利用乳酸菌耐酸、耐胆盐、免疫佐剂功能及乳酸菌肠道黏附定植功能,诱导肠道黏膜免疫系统,通过乳酸菌非特异性抗菌、抗腹泻作用及抗轮状病毒特异性免疫,试图达到合理防治猪轮状病毒感染的目的。本研究利用CRIPSR-Cas9D10A基因组编辑系统敲除猪源副干酪乳杆菌HLJ-27（L.paracasei HLJ-27）中的丙氨酸消旋酶基因（Alanine racemase,Alr）,构建了营养缺陷型重组菌L.paracasei△HLJ-27;在此基础上,在基因组胸苷酸合成酶位点（thymidine synthase,thy A）插入PoRV的中和保护性抗原VP4,构建了可以稳定表达外源蛋白的营养缺陷型菌株L.paracasei VP4/△HLJ-27,实现了对菌株的人工控制并为食品级选择标记的建立奠定了基础。之后将重组菌VP4/△HLJ-27口服免疫小鼠及仔猪,测定了体液免疫应答、黏膜免疫应答和细胞免疫应答。由于猪轮状病毒多与其他病原呈混合感染或继发感染导致仔猪死亡,因此本研究选择监测口服免疫重组菌56天内抗体水平变化替代攻毒保护试验以评价其免疫效果。主要研究结果如下:1、构建了营养缺陷型重组菌L.paracasei△Alr HLJ-27利用基因编辑质粒pLCNICK-DA1敲除了猪源L.paracasei HLJ-27基因组的Alr基因,构建了丙氨酸营养缺陷型菌株L.paracasei△Alr HLJ-27。首先,将基因编辑质粒pLCNICK-DA1电转入L.paracasei HLJ-27感受态细胞中,获得的重组菌经基因组PCR鉴定,结果显示大小分别约2700 bp（敲除前）和约1500 bp（敲除后）两条目的带,说明CRIPSR-Cas9D10A系统成功对基因组进行了编辑,基因编辑质粒的效率为87.5%,进一步纯化后获得了突变型菌株L.paracasei△Alr HLJ-27。之后,检测了突变型菌株L.paracasei△Alr HLJ-27对D-丙氨酸的需求情况,结果显示重组菌仅在外源添加D-丙氨酸或者转入携带有Alr基因互补质粒时才能恢复生长,说明成功构建了Alr基因缺陷型重组菌。另外,进一步对缺陷型菌株△Alr HLJ-27的生长特性、遗传稳定性、质粒消除情况、菌体形态、高温耐受性及耐酸、耐胆盐情况进行了检测,结果表明与亲本株相比未发生显著变化。2、构建了基因组表达PoRV VP4基因的营养缺陷型重组菌VP4/△HLJ-27利用CRIPSR-Cas9D10A系统,将PoRV VP4基因插入L.paracasei HLJ-27基因组thy A位点,构建了表达外PoRV VP4基因的营养缺陷型重组菌VP4/△HLJ-27。首先,基于thy A位点设计了三条sgRNAs序列,构建了基因编辑质粒,电转入营养缺陷型菌株△Alr HLJ-27感受态后基因组PCR鉴定结果显示为两条特异性条带,分别为敲除前1849 bp和插入后2657 bp,说明CRIPSR-Cas9D10A系统成功对基因组进行了编辑;三个sgRNAs基因组编辑效率分别为66.7%、45.8%和91.6%,经进一步纯化后获得了突变型菌株VP4/△Alr HLJ-27。之后,检测了突变型菌株VP4/△Alr HLJ-27对D-丙氨酸的需求情况,结果表明菌株需要外源添加D-丙氨酸才能够恢复生长,符合营养缺陷的特征;Western blot及间接ELISA结果表明,重组菌VP4/△Alr HLJ-27外源基因VP4获得表达。另外,与亲本株相比,重组菌生长特性、遗传稳定性、质粒消除情况和菌体形态等均未发生明显变化。3、重组菌VP4/△HLJ-27口服免疫动物后所诱导的免疫应答将重组菌VP4/△HLJ-27口服免疫小鼠,采集免疫后小鼠的粪便、肠黏液、阴道灌洗液和血清,以PoRV为包被抗原,经间接ELISA检测结果显示,小鼠体内的SIg A和Ig G水平显著升高;血清中和抗体滴度为1:32;血清中的细胞因子IL-4、IL-2、IL-10、IL-12、IL-17和IFN-γ测定结果表明,重组菌可显著刺激小鼠产生Th1、Th2及Th17型细胞免疫,且免疫反应中以Th1免疫反应为主;口服免疫VP4/△HLJ-27重组菌的小鼠第42天后,CD4+T、CD8+T及脾淋巴细胞增殖情况均显著高于对照组,表明口服重组菌VP4/△Alr HLJ-27成功激活了小鼠体内的细胞免疫应答。以重组菌VP4/△HLJ-27口服免疫仔猪,采集免疫后仔猪的鼻、肛拭子和血清样本。以PoRV病毒作为包被抗原,ELISA检测结果显示,与小鼠免疫结果相同,仔猪血清中特异性Ig G抗体水平和鼻、肛拭子中特异性SIg A抗体水平较对照组相比均显著升高;仔猪血清中的细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IL-17和IFN-γ水平均较对照组相比显著升高,表明重组菌可刺激仔猪产生Th1、Th2及Th17型细胞免疫,并以Th1免疫反应为主。综上所述,口服重组菌VP4/△HLJ-27免疫小鼠和仔猪可以诱导产生黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答。