目的:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者大多数肝内存在弥漫性小病灶或者在单结节周围伴有卫星灶,容易发生肝内转移。肝内微小的转移灶,即微转移,是造成肝癌高转移率的主要原因。肝癌微转移是指播散于人体多种组织器官的微小肿瘤灶,通常没有显著的临床症状。肿瘤微环境是影响HCC发生发展的重要因素,其中低氧、低PH等理化微环境是促进肝癌侵袭迁移的关键因素,其具体机制目前仍未完全揭示。低氧是肝癌作为实体瘤最具特征的理化因素之一,是由肝癌细胞过度增殖和血管系统异常紊乱导致的细胞供氧不足而造成的。低氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）是肝癌细胞适应低氧的主要调节因子,HIF-1α通过结合其靶基因启动子激活基因转录,从而导致肝癌细胞具有更强的侵袭和迁移的能力。因此低氧对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响值得深入探索。肝癌细胞侵袭迁移的一个关键步骤是细胞与细胞相互作用的丧失以及细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的重塑所促成的。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）在组织重塑过程中引起ECM重塑,提高肝癌细胞的侵袭迁移能力。MMPs表达水平、活性以及分布都具有重要的诊断和预后价值。低氧与ECM共同构成肝癌细胞侵袭迁移的微环境,近年来的研究表明低氧可以引起细胞外基质的重塑,但是低氧引发细胞外基质重塑的机制尚未见系统和深入的研究。循环内体在细胞内的货物运输和信号传导过程中发挥重要作用。Rab蛋白家族在生物膜上广泛分布,参与细胞内囊泡的转运和生物膜融合,其中Rab11a是小分子GTP结合蛋白（Rab GTPases,Rabs）家族中进化比较保守的一个亚型,通过与下游分子的瞬时相互作用调控循环内体与质膜的融合,将循环内体中来源于高尔基体的活性内容物释放至细胞外。Rab11a通过调节循环内体中的整合蛋白促进肿瘤细胞的侵袭迁移,但具体机制并未阐明。外囊复合物是一种多蛋白复合物,是介导循环内体与质膜融合释放活性内容物过程的关键调控蛋白,其中外囊复合物亚单位Exo70通过与细胞膜上的磷脂酰肌醇二磷酸（phosphatidylinositol（4,5）bisphosphate,PI（4,5）P2）的相互作用介导循环内体与细胞质膜的融合。目前对循环内体运输以及释放等相关机制仍有待深入的研究,关于循环内体和外囊复合物在胞吐过程中的调控机制以及二者发挥功能的上下游关系尚未得到阐释。这些问题的存在,直接阻碍了循环内体胞吐对肝癌细胞生物学行为过程的理解。低氧作为驱动肝癌进展的核心因素,其通过多种途径发挥调控作用。越来越多的研究报道了循环内体介导的物质运输在肿瘤进展中的意义。同时低氧作为一种肿瘤常见的应激环境也可以显著调控循环内体的活性。因此本研究试图探究循环内体在低氧环境下是否发挥关键的调控肿瘤侵袭迁移等生物学行为的作用。进一步探究在低氧环境下肝癌细胞循环内体释放MMPs的机制对肝癌治疗有深远意义。本研究通过生物信息学、临床肝癌组织样本、动物模型以及低氧细胞模型,探究低氧条件下循环内体如何调控肝癌细胞侵袭迁移的能力。通过免疫组织化学、共聚焦成像以及蛋白免疫共沉淀等实验方法进一步探究低氧调控循环内体释放MMPs促进肝癌细胞侵袭迁移的分子机制。研究方法:1、低氧增强肝癌细胞的侵袭迁移能力:（1）为了探究肝癌组织中HIF-1α与侵袭迁移功能的相关性,通过癌症基因组图谱（the cancer genome atlas,TCGA）数据库提取371例肝癌组织样本中HIF-1α的表达情况,利用基因富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA）明确肝癌组织中HIF-1α相关的侵袭迁移功能。（2）为了明确HIF-1α与侵袭迁移指标表达水平的相关性,采用免疫组化（immunohistochemistry,IHC）染色明确HIF-1α与临床病理特征的相关性。通过实时荧光定量PCR分析（real-time quantitative PCR,q RT-PCR）、免疫印迹（western blot,WB）以及免疫组化检测肝癌组织中HIF-1α与E-Cadherin、N-Cadherin、VEGFR、MMP2、MMP9、MMP14表达水平。（3）为了探究HIF-1α对肝癌细胞侵袭迁移的影响,利用q RT-PCR、western blot以及免疫组化分析小鼠肝癌组织中HIF-1α对MMP9的调控。通过低氧孵育箱模拟低氧环境（1%O2）培养肝癌细胞共计24小时,利用Transwell实验分析低氧条件下肝癌细胞的侵袭迁移能力。2、循环内体释放MMP9介导低氧增强肝细胞癌侵袭迁移能力:（1）为了明确低氧促进循环内体释放MMP9,通过低氧以及侵袭迁移相关的基因进行功能富集分析（gene ontology,GO）。采用共聚焦分析低氧条件下肝癌细胞中囊泡与MMP9的空间定位。利用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）分析低氧条件下肝癌细胞上清中MMP9的表达。通过western blot检测低氧条件下转染慢病毒sh-Rab11a的肝癌细胞上清MMP9的表达。（2）为了探究低氧介导循环内体增强肝癌细胞侵袭迁移能力,利用TCGA数据库分析肝癌组织中HIF-1α与Rab11a表达的相关性。通过共聚焦分析低氧条件下肝癌细胞中循环内体的变化。为了研究低氧促进循环内体装载MMP9,采用TCGA数据库分析肝癌细胞中Rab11a与MMP9表达水平的相关性,接着利用共聚焦分析低氧条件下Rab11a与MMP9的共定位情况。利用Transwell实验分析低氧条件下肝癌细胞循环内体与侵袭迁移能力相关性。（3）为了明确HIF1-α转录调控Rab11a的表达,通过q RT-PCR以及免疫印迹western blot检测Rab11a的表达水平。利用荧光素酶报告检测HIF1-α与Rab11a启动子的结合。（4）为了明确小鼠体内HIF-1α通过Rab11a释放MMP9,通过对小鼠原位肝癌低氧模型进行称重测量。利用q RT-PCR、western blot以及免疫组化分析MMP9的表达。3、低氧通过Exo70调控循环内体释放MMP9增强肝癌细胞侵袭迁移能力:（1）为了明确在低氧条件下Rab11a与Exo70的结合,通过Co-IP实验检测肝癌细胞中Exo70与Rab11a的相互作用。（2）为了明确低氧条件下Exo70的磷酸化位点,利用免疫共沉淀（co-immunoprecipitation,Co-IP）实验检测低氧条件下Exo70的磷酸化水平变化。通过构建Flag-Exo70质粒转染肝癌细胞,检测体外磷酸化反应体系中激酶实验。（3）为了探究在低氧条件下Rab11a与Exo70磷酸化位点的结合,利用Co-IP实验明确在低氧条件Exo70与Rab11a的相互作用位点。利用Flag、Myc标记的Exo70（S59A）质粒转染细胞,通过Co-IP实验明确在低氧条件Exo70与Rab11a的相互作用位点。（4）为了探究在低氧条件下Exo70磷酸化位点调控肝癌细胞MMP9的释放,ELISA分析低氧条件下肝癌细胞上清中MMP9的表达情况。同时通过western Blot分析肝癌细胞上清中MMP9的表达。利用Transwell实验分析低氧条件下肝癌细胞的侵袭迁移能力。结果:1、低氧增强肝癌细胞的侵袭迁移能力:（1）GSEA分析发现HIF-1α与细胞黏附分子（P=0.001）、细胞外基质（P=0.001）等呈正相关性。免疫组化染色发现HIF-1α的表达与肝癌大小（P=0.0177）、临床分期（P=0.0017）呈正相关性。（2）q RT-PCR、western blot以及免疫组化检测肝癌组织显示HIF-1α与MMP9表达水平成正相关性。（3）ELISA、western blot检测小鼠肝癌发现sh-HIF-1α组中小鼠肝癌细胞上清中MMP9表达降低（P＜0.001）。低氧条件下肝癌细胞上清中MMP9蛋白表达显著升高,且低氧条件下肝癌细胞穿过Transwell细胞小室的数目较常氧条件下显著增多（P＜0.01）。2、循环内体释放MMP9介导低氧增强肝癌细胞侵袭能力:（1）低氧以及侵袭迁移指标MMP9涉及的相关功能包括内体运动、细胞骨架、细胞黏附、细胞外基质等。共聚焦成像检测显示低氧条件下循环内体装载MMP9。ELISA分析结果显示MMP9的释放由低氧下循环内体Rab11a调控释放的（P＜0.01）。western blot检测发现低氧通过调控循环内体释放MMP9。（2）TCGA数据库分析发现肝癌组织中HIF-1α与Rab11a表达水平成正相关性。共聚焦成像检测显示低氧条件下循环内体表达数量。TCGA数据库分析发现肝癌组织中Rab11a与MMP9表达水平成正相关性。共聚焦成像检测显示低氧条件下循环内体在肝癌细胞中与MMP9共定位更加显著。Transwell侵袭迁移实验发现稳转敲除Rab11a下的肝癌细胞穿过细胞小室的数目显著增加（P＜0.01）。（3）q RT-PCR、western blot检测发现低氧条件下肝癌细胞中HIF-1α以及Rab11a均显著升高。荧光素酶报告基因明确表明HIF-1α与Rab11a的启动子存在结合（P＜0.01）,促进Rab11a转录。（4）小鼠体内实验明确HIF-1α通过Rab11a促进MMP9释放。3、低氧通过Exo70调控循环内体释放MMP9介导肝癌细胞侵袭迁移:（1）Co-IP实验明确低氧条件促进Exo70与Rab11a的结合。（2）Co-IP实验结果表明肝癌细胞在低氧条件下Exo70的磷酸化水平增加。（3）通过Flag、Myc标记的Exo70（S59A）突变质粒发现Exo70 Ser59位点的突变减弱低氧条件下Exo70与Rab11a的结合。（4）ELISA、western blot实验分析发现低氧条件下Exo70 Ser59位点的突变会减少MMP9的释放（P＜0.05）。Transwell实验明确低氧条件下Exo70（S59A）位点的突变会降低肝癌细胞的侵袭迁移能力（P＜0.001）。结论:1、HIF-1α蛋白表达水平与肝癌的侵袭迁移基因集呈正相关。HIF-1α的蛋白表达水平与肝癌大小、临床分期显著正相关。肝癌组织中HIF-1α与MMP9蛋白表达水平呈正相关。低氧促进肝癌细胞中MMP9的释放,同时低氧增强肝癌细胞的侵袭迁移能力。2、低氧促进肝癌细胞循环内体MMP9释放。HIF-1α作为转录因子可与Rab11a的启动子结合,转录调控Rab11a的表达。低氧条件下通过循环内体释放MMP9增强肝癌细胞侵袭迁移能力。3、低氧促进肝癌细胞Rab11a与Exo70的结合。低氧促进Exo70第59位点丝氨酸的磷酸化。低氧条件下Exo70 Ser59位点磷酸化调控循环内体释放MMP9增强肝癌细胞侵袭迁移能力。