【摘 要】
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背景:类风湿关节炎是一种以侵蚀性、慢性对称性多关节炎的自身免疫病,典型病理变化是关节滑膜异常增生以及软骨和骨质的破坏,FLSs在RA发病过程中发挥核心作用,RAFLSs异常表达miRNA参与RA关节炎症、滑膜增生、组织破坏;MSC-Exos为MSCs产生的30-150 nm膜分泌体系,既保留了MSCs功能,又具备精准高效的传递方式和易于保存和调控的结构优势,MSC-Exos内含的miRNA是MSC
【基金项目】
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国家自然科学基金“人脐带间充质干细胞微泡通过传递miRNA影响类风湿关节炎患者滑膜成纤维细胞功能及机制的研究（编号:81871292）”；
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背景:类风湿关节炎是一种以侵蚀性、慢性对称性多关节炎的自身免疫病,典型病理变化是关节滑膜异常增生以及软骨和骨质的破坏,FLSs在RA发病过程中发挥核心作用,RAFLSs异常表达miRNA参与RA关节炎症、滑膜增生、组织破坏;MSC-Exos为MSCs产生的30-150 nm膜分泌体系,既保留了MSCs功能,又具备精准高效的传递方式和易于保存和调控的结构优势,MSC-Exos内含的miRNA是MSC-Exos生物学效应的关键分子,miRNA在生物体内定向转运具备极髙的治疗和转化应用前景。那么hUCMSC-Exos是否可以将miRNA递送至RAFLSs并影响其生物学性状,有待进一步研究验证。目的:hUCMSC-Exos能否将RNA递送至RAFLSs;hUCMSC-Exos是否通过传递miRNA影响RAFLSs增殖、迁移。方法:1.RAFLSs对hUCMSC-Exos RNA的摄取作用组织贴壁法分离培养原代hUCMSCs,流式细胞术鉴定表面标记,采用差速离心法联合超滤法获取hUCMSC-Exos,进一步通过电镜、纳米颗粒追踪分析、高灵敏纳米粒度分析及BCA法鉴定Exos;胰酶消化法分离培养原代RAFLSs,流式细胞术鉴定表面标志;标记hUCMSC-Exos的RNA,hUCMSC-Exos与RAFLSs共培养24h,经处理后置于荧光显微镜观察。2.构建hUCMSCs KD-Ago2慢病毒GV493感染hUCMSCs确定最适感染条件;随后分别用3个载有可敲低Ago2的不同si RNA靶点序列的慢病毒GV493感染hUCMSCs,RT-PCR法、Westen blot法检测Ago2在hUCMSCs、hUCMSCs KD-Ago2、hUCMSCs NC的表达情况,确定敲低效率最高靶点用于构建hUCMSCs KD-Ago2。3.检测hUCMSCs-Exos中miRNA对RAFLSs影响差速离心法联合超滤法获取Ago-2基因敲低的hUCMSCs来源的Exos即hUCMSCKD-Ago2-Exos、Ago-2基因未敲低的hUCMSCs来源的Exos即hUCMSCNC-Exos,采用实时无标记细胞检测仪研究不同浓度hUCMSC-Exos对RAFLSs的增殖、迁移影响,确定最适干预浓度,进一步采用实时无标记细胞检测仪比较hUCMSCKD-Ago2-Exos、hUCMSCNC-Exos及空白对照组对RAFLSs的增殖、迁移影响。结果:原代hUCMSCs呈梭形纺锤样,CD105、CD73、CD90阳性,CD45、CD34、HLA-DR阴性,符合hUCMSCs表征;原代RAFLSs形态呈纤维梭状,PDPN、CDH-11阳性、CD68阴性,符合RAFLSs表征;标记RNA的hUCMSC-Exos与RAFLSs共孵育可见蓝染的RAFLSs核周围聚集绿色荧光物质,RAFLSs可以摄取hUCMSC-Exos的RNA。慢病毒GV493感染hUCMSCs感染难度适中,感染后的细胞增殖正常,最适感染条件为添加感染增强液Hi Trans G P、MOI=20,且3个载有不同靶点序列的慢病毒均可成功感染hUCMSCs;RT-PCR和Western blot检测感染hUCMSCs中Ago2基因的敲减效率,确定病毒靶点LVPSC85386-11感染hUCMSCs用于实验。经鉴定hUCMSC-Exos、hUCMSCKD-Ago2-Exos、hUCMSCNC-Exos为直径30～150nm典型杯托状、形态完整的膜性囊泡,蛋白浓度分别为1.384ug/ul、1.133ug/ul、1.038ug/ul,上述结果均符合其标准。hUCMSCKD-Ago2-Exo、hUCMSCNC-Exos干预RAFLS,同时间点hUCMSCKD-Ago2-Exos组、hUCMSCNC-Exos组均抑制RAFLSs增殖、迁移,hUCMSCNC-Exos组作用最强,差异具有统计学意义（p<0.01、p<0.05）;干预组和空白对照组中每一组在不同时间点处的RAFLSs增值、迁移的细胞指数均具有统计学差异（p<0.01、p<0.05）,且每组组间整体均有统计学差异（p<0.01、p<0.05）。结论:hUCMSC-Exos RNA被RAFLSs摄取后可能通过miRNA影响RAFLSs增殖、迁移。
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