狂犬病是由狂犬病毒引起的人畜共患的较为古老的自然疫源性传染病。发病后死亡率高达100%。狂犬病毒属于弹状病毒科狂犬病毒属,是单股负链RNA。主要编码五种结构蛋白,核蛋白(N),磷蛋白(P),膜蛋白(M),糖蛋白(G)和转录酶大蛋白(L)。作为最早巴斯德开发出的病毒疫苗,狂犬疫苗的制备与使用已相对成熟。然而,对狂犬病的治疗至今尚无有效的方法,对狂犬病毒感染及早有效检测,监测实验动物和野生动物自然感染及评价狂犬疫苗免疫效果,及时有效的隔离和处理已感染群体,是减少人员伤亡和经济损失的有效手段狂犬病毒磷蛋白占病毒蛋白总量的6%,为高度亲水性蛋白。磷蛋白为病毒RNA聚合酶的辅助因子,是一种多功能蛋白,同时在免疫反应中发挥重要作用。磷蛋白可通过与STAT1互作,抑制干扰素信号转导途径,阻止病毒感染细胞的抗病毒反应,对抗宿主细胞的自身免疫反应,也是免疫反应的重要调控因子。对狂犬病毒磷蛋白单链抗体的研究,在狂犬病毒的临床诊断和治疗中都有重要实际应用意义。为对狂犬病毒重组磷蛋白进行表达与纯化,首先利用primer 5软件,根据NCBI中检索出的狂犬病毒磷蛋白基因序列,设计可扩增引物两端带有EcoRI和SalII酶切位点的特异性引物。将扩增的目的基因插入PET-32a表达载体,经过PCR验证和公司测序分析,获得了阳性克隆。基因经诱导表达,SDS-PAGE进行蛋白检测,结果表明重组蛋白大量表达在包涵体中,经蛋白纯化、复性、透析与真空冷冻干燥,可得到高浓度的狂犬病毒重组磷蛋白。ELISA和Western blot实验结果表明表达的重组蛋白分子量为53KD,具有较好的抗原性。进而,用获得的重组磷蛋白免疫小鼠,取免疫成功的小鼠脾脏细胞,与生长状态良好的小鼠骨髓瘤细胞的进行细胞融合,使用间接ELISA和间接免疫荧光筛选杂交瘤细胞,并测定上清中抗体特异性与抗体浓度。最终我们获得了一株分泌抗狂犬病毒磷蛋白抗体的杂交瘤细胞株1A4。用该阳性杂交瘤细胞制备腹水,经进行纯化和特异性检测发现,该细胞株所分泌抗体能有效识别狂犬病毒蛋白。最后,从阳性杂交瘤细胞株扩增分泌抗体的重链和轻链可变区基因,并构建狂犬病毒磷蛋白单链抗体的表达载体。在设计单链抗体表达载体时,我们在C末端加入了碱性磷酸酶基因,表达产物为单链抗体与碱性磷酸酶的融合蛋白,可以作为直接抗体,检测时无需二抗,省时、省力、易于制备,生产成本大大降低。经Western blot和间接免疫荧光检测发现,表达获得的抗磷蛋白单链抗体有很好的狂犬病毒磷蛋白结合效果。经对狂犬病临床样本初步检测发现,以最适用量的单链抗体,通过竞争性ELISA实验有很好的检测效果,制备的单链抗体具有较好的产品开发前景。本研究成功制备了狂犬病毒磷蛋白,并在此基础上成功制备出特异性较高的的单克隆抗体和单链抗体。单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白作为直接抗体,不仅为实验节省了时间和二抗材料,在抗体检测应用中,也打破传统抗体商品化试剂盒在检测物种上的限制,无需考虑因检测对象差异需要配套相应二抗的问题,为狂犬病毒诊断和动物免疫效果评价提供技术支持。