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研究背景类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis,RA）是临床上常见的慢性全身性免疫性疾病,遗传、环境及免疫系统等相互作用会导致RA的发生。现代研究表明,肠道菌群紊乱与多种疾病的发生关系密切,其中包括机体肠道菌群紊乱与RA的发生,肠道菌群紊乱可加重RA病变。此外,研究发现RA患者肠黏膜免疫失调。因此通过调节肠道菌群和肠道黏膜免疫共同构成的肠道微环境,可能改善RA。中医理论认为,脾胃为后天之本,气血生化之源。脾主四肢肌肉,脾胃虚弱可以导致四肢肌肉失于濡养,若受风寒湿邪侵袭,正气愈虚,驱邪愈无力,可使RA病情缠绵,所以补益脾胃是临床治疗RA的基本法则之一。近年研究提示,脾虚证（Spleen Deficiency,SD）与肠道微环境密切相关,SD在一定程度上能加重RA。中药复方的基础研究和临床应用研究表明,益气健脾类中药复方具有良好的调节肠道微环境的功效。芎附散（Xiong Fu Powder,XFP）出自《普济本事方》,是基于益气健脾法治疗脾虚痹证的经典代表古方。课题组前期研究发现脾虚痹证小鼠模型的肠道黏膜免疫系统存在异常,且SD能够加重RA发展,XFP可通过缓解SD从而调节肠道黏膜免疫系统,起到改善RA的作用。另有体外研究表明XFP的多种组分均能够调节肠道菌群,但具体机制尚未完全明了。因此,深入研究XFP是否通过改善SD加重的肠道微环境紊乱以发挥治疗RA的作用,对中医药从脾论治RA及RA治疗新思路的开发具有重要意义。研究目的本研究聚焦于肠道微环境,通过建立脾虚痹证（胶原诱导性关节炎）（SD-Collagen Induced Arthritis,SD-CIA）大鼠模型,采用益气健脾代表方XFP进行干预,探讨SD通过肠道微环境加重CIA发病及XFP对其的药效及可能的作用机制。实验方法提取大黄及XFP水煎液,通过超高效液相色谱-质谱联用法（Ultra High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,UHPLC-MS）分析二者成分。将50只雄性Sprague Dawley大鼠随机分成空白对照组（Control组）、CIA组、SD组、SD-CIA组及XFP组,每组10只。CIA组:使用牛Ⅱ型胶原（Bovine TypeⅡCollagen）及不完全氟氏佐剂（Incomplete Freuad’s Adjuvant,IFA）的乳化剂于大鼠尾根部皮下注射制作CIA大鼠模型。SD组:灌胃大黄煎液与饥饱失常诱导脾虚证。SD-CIA及XFP组:SD联合CIA造模。SD组:维持大黄泻下及不规律饮食至实验结束,不进行其他处理;CIA组和SD-CIA组:灌服蒸馏水10mL/kg;XFP组:以XFP煎剂23 g/kg/day给予灌胃,每天一次,连续灌胃34天;其余组灌服等体积的蒸馏水。实验期间观察大鼠的一般状态,每隔3天进行关节炎评分及称重一次,至实验结束。利用H＆E染色及Micro-CT法评估XFP对SD-CIA大鼠踝关节病理特征与骨侵蚀的影响;应用流式细胞术分析小肠淋巴结（peyer’s patches,PP结）中的Tregs和Th17比例;通过实时荧光聚合酶链式反应（Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction,qRT-PCR）法测定肠组织中炎性基因肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α、白介素（Interleukin,IL）-1β、IL-6、IL-10及IL-17等的相对表达水平;通过 ELISA 法测定血清中抗Ⅱ型胶原抗体（Anti-collagen Type Ⅱ Antibody,anti-Col Ⅱ Ab）水平及空肠与回肠匀浆中sIgA的水平;采用免疫组织化学方法（Immunohistochemistry,IHC）对空肠与回肠中的分泌型免疫球蛋白A（Secretory Immunoglobulin A,sIgA）进行半定量分析。利用宏基因组测序法检测大鼠肠道微生物的分布与功能;采用相似性分析法（Analysis of Similarities,Anosim）与主坐标分析法（Principal Coordinates Analysis,PCoA）分析菌群组内相似性与组间差异;使用线性判别分析法（Linear Discriminant Analysis Effect Size,LEfSe）确定各组大鼠菌群生物标志物;比对Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）数据库对肠道微生物群进行不同水平功能富集;通过非度量多维尺度（Non-Metricmulti-Dimensional Scaling,NMDS）分析菌群功能相似度;使用LEfSe分析法判别各组间有显著差异的通路。研究结果1大黄及XFP水提物质量符合实验要求通过UHPLC-MS法确定大黄及XFP质量,结果表明二者质量符合实验要求,可用于后续实验。2 XFP对SD-CIA大鼠脾虚证的影响与Control组相比,SD组与SD-CIA组出现精神萎靡、鼠毛枯疏无光泽,倦怠,懒动,稀便等情况,SD-CIA组较CIA组更严重;与SD-CIA组相比,XFP组的精神充沛,鼠毛有光泽、行动敏捷、粪便成型。造模给药干预后大鼠体重变化:与CIA组相比,从大黄干预第一周起,SD-CIA组的体重呈明显的下降趋势（P＜0.01）;与SD-CIA组相比,治疗2周后,XFP组大鼠的体重呈明显的升高趋势（P＜0.05）。3 XFP对SD-CIA大鼠关节炎的作用Anti-Col Ⅱ Ab ELISA 结果显示:与 CIA 组相比,SD-CIA 组血清中 anti-Col Ⅱ Ab 水平显著升高（P＜0.05）;与SD-CIA相比,XFP组血清中的anti-Col ⅡAb水平具有显著下降趋势（P＜0.01）。XFP干预后大鼠踝关节病理变化:与CIA组对比,SD-CIA组大鼠的踝关节及以下部位均发生严重肿胀,双后肢关节炎评分（Arthritis Index,AI）和踝关节的病理评分较高（P＜0.05）;与SD-CIA组对比,XFP组的大鼠踝关节及以下的肿胀程度有缓解趋势,且双后肢AI评分及踝关节病理评分显示出统计学差异（P＜0.05,P＜0.01）。Micro-CT结果显示:与CIA组相比,SD-CIA组的踝关节BS值升高（P＜0.01）;BV 值降低（P＜0.01）;BS/BV 值升高（P＜0.05）。与 SD-CIA组相比,XFP组的BS值有下降的趋势,但没有显著性差异;BV值显著升高（P＜0.05）;BS/BV值显著降低（P＜0.05）。抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrate-Resistant Acid Phosphatase,TRACP）染色法结果显示:与CIA组相比,SD-CIA组踝关节中的破骨细胞（Osteoclasts,OCs）数量增多（P＜0.01）;与SD-CIA组相比,XFP组踝关节中的OCs数量下降（P＜0.01）。4 XFP对SD-CIA肠道微环境紊乱的影响流式细胞实验结果如下:与CIA组相比,SD-CIA组小肠PP结中的Tregs和Tregs/Th17比值均显著降低（P＜0.05）;与SD-CIA组相比,XFP组的Tregs数目和Tregs/Th17比值均显著上升（P＜0.05,P＜0.01）。与CIA组相比,SD-CIA组的Th17细胞数量显著升高（P＜0.05）;与SD-CIA组相比,XFP组的Th17细胞数量呈显著降低的趋势（P＜0.05）。各组大鼠空肠与回肠组织中相关炎性基因表达结果如下:与CIA组相比,SD-CIA组空肠与回肠中的TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-17的mRNA表达上调,其中除SD-CIA组的IL-6mRNA无差异外,其余基因的表达水平与CIA组相比均有显著性差异（P＜0.05）;与SD-CIA相比,XFP组中上述四个基因的相对表达水平显著下调（P＜0.01）。与CIA组相比,SD-CIA组空肠与回肠中的IL-10的表达水平具有降低的趋势（P＜0.05）;与SD-CIA组相比,XFP组IL-10的表达水平明显升高（P＜0.01）。SIgAELISA法结果:与CIA组相比,SD-CIA组空肠与回肠中的sIgA表达显著降低（P＜0.05）;与SD-CIA相比,XFP组空肠与回肠中sIgA的表达水平明显升高（P＜0.01）。IHC实验结果显示:与CIA组相比,SD-CIA组空肠与回肠组织中的sIgA表达密度明显降低（P＜0.01）;与SD-CIA组相比,XFP组空肠与回肠组织中sIgA的表达密度明显升高（P＜0.01）。宏基因检测法检测肠道菌群,结果如下:在丰度排名前10位的菌门中,厚壁菌门（Firmicutes）占主导地位,其次是衣原体（Chlamydiae）。XFP 组的 Firmicutes、Control组的 Chlamydiae、SD-CIA 组的变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）占比居高。采用Anosim法检测各组大鼠间菌群分布差异,结果如下:与Control组对比,SD-CIA组和XFP组在属水平上的微生物区系的分布存在显著差异（P＜0.05）。然而,SD-CIA组和XFP组之间没有差异。进一步通过PCoA法分析各组菌群结构分布,发现XFP组中一个样本与SD-CIA组高度相似,推测为造成Anosim分析中SD-CIA组和XFP组无差异的原因。此外,使用LEfSe法得到各组的生物标志物,发现XFP组以乳杆菌目（Lactobacillales）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）、乳杆菌属（Lactobacillus）及嗜酸乳杆菌（Lactobacillus.acidophilus）为优势菌。最后,分析各组中丰度最高的10个种属,与Control组相比,SD-CIA组的L.acidophilus、罗伊氏乳酸杆菌（L.reuteri）、毛螺旋菌属（P.excrementihominis）和Firmicutes M1 0-2的丰度均下调;与SD-CIA组相比,XFP组的上述微生物的丰度增加。然而,约氏乳杆菌（L.johnsonii）却有相反的趋势。与LEfSe分析一致,XFP组中的乳杆菌属（Lactobacillus）和嗜酸性乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）丰度最高。比对KEGG数据库分析肠道菌群各级通路,各组均发现KEGG级别1中的代谢通路（Metabolism）、遗传信息通路（Genetic Information Processing）和细胞通路（Cellular Processes）等。通过 NMDS 法分析样本相似度,发现除XFP组的1个样本外,各组样本分布都较为集中。另外,我们使用LEfSe分析法寻找各组间有显著差异的通路,发现XFP组肠道菌群的优势通路是Quorum sensing,其次是ABC Transporters。最后,我们分析了 XFP组大鼠中高丰度的菌种与发挥优势功能的信号通路之间的关系,结果表明:7个菌种均与Quorum sensing和 ABC Transporter 相关。结论SD可加重CIA发病。XFP可通过调节肠道微环境减轻SD-CIA大鼠发病程度。其机制与肠黏膜Tregs/Th17细胞调控的sIgA分泌与Quorum sensing介导的乳酸杆菌属（尤其是嗜酸乳杆菌）粘附之间的相互作用有关。