【摘 要】
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[目的]周围神经浸润是结直肠癌转移和侵袭的标志,提示患者预后不良。而研究表明MDK是一个肝素结合性生长因子,在胚胎发育时期促进神经细胞生长发育。MDK在结直肠癌中的高表达目前已被证明与结直肠癌的侵袭,转移,耐药密切相关。因此肿瘤细胞分泌MDK可能调控神经生长相关信号,促进神经浸润的发生。本课题旨在探究MDK在结肠癌中促进背根神经节神经元轴突向肿瘤细胞生长。[方法]1.通过生物信息学方法,基于TCG
【基金项目】
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云南省科技厅重点项目（2018FA040）；
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[目的]周围神经浸润是结直肠癌转移和侵袭的标志,提示患者预后不良。而研究表明MDK是一个肝素结合性生长因子,在胚胎发育时期促进神经细胞生长发育。MDK在结直肠癌中的高表达目前已被证明与结直肠癌的侵袭,转移,耐药密切相关。因此肿瘤细胞分泌MDK可能调控神经生长相关信号,促进神经浸润的发生。本课题旨在探究MDK在结肠癌中促进背根神经节神经元轴突向肿瘤细胞生长。[方法]1.通过生物信息学方法,基于TCGA数据库基因表达数据和临床数据,探索MDK的表达与结肠癌神经浸润的发生之间的相关性,并初步探讨高表达MDK结肠癌患者的预测价值;2.利用重组MDK蛋白分别培养新生SD大鼠背根神经节,并设置空白对照组,免疫荧光染色定量分析轴突生长情况,探索MDK对鼠背根神经节轴突生长的作用;3.分别用不同浓度（600ng/ml,800ng/ml,1000ng/ml,1200ng/ml）的重组 MDK 蛋白培养新生SD大鼠背根神经节,在1天,3天,5天,7天分别拍照记录,最后免疫荧光染色定量分析轴突生长情况,确定鼠背根神经节神经元轴突生长的最适浓度和最适测量时间;4.建立SW620,SW480和HT29肠癌细胞系分别与鼠背根神经节三维共培养模型,在1天和5天分别拍照记录,最后倒置显微镜成像系统拍照记录轴突生长情况,探究鼠背根神经节神经元是否向肠癌细胞浸润生长;5.分别设置 MDK+Bay11-7082-组,MDK-Bay11-7082+组,MDK+Bay11-7082+组和MDK-Bay1 1-7082-组,通过WesternBlot方法检测目标药物处理后神经元的蛋白水平改变,观察各组ALK/PI3K/Akt信号通路及关键传导信号NF-κB蛋白水平的改变,并通过免疫荧光染色鉴定各组神经元轴突的变化。[结果]1.根据TCGA数据库的临床数据和基因表达数据,结果显示伴有神经浸润的结肠癌病人MDK表达量要显著高于不伴有神经浸润的结肠癌病人（p=0.041）,并且较高表达MDK的病人预示着更差的预后（p=0.04）;2.显微镜明场下拍照和免疫荧光结果显示,加入重组MDK蛋白组的神经元轴突生长长度和轴突数量显著多于加入PBS对照组;3.用不同浓度重组MDK蛋白处理的鼠背根神经节神经元,结果显示800ng/ml浓度重组MDK蛋白处理的神经元轴突数量和长度明显好于其他浓度,但没有明显浓度依赖性;4.与空白对照相比,加入重组MDK蛋白的背根神经节轴突向肠癌细胞生长指数差异更明显;而且在三株细胞中,SW620组的背根神经节轴突生长指数差异最明显（Outgrowth Index＞1,p＜0.0001）。故MDK可以促进背根神经节轴突向肠癌细胞生长;5.与不加重组MDK蛋白相比,在加入重组MDK蛋白组中ALK,Akt及NF-κB的表达量明显增加,但BDNF表达量无明显变化;在加入NF-κB抑制剂一Bay11-7082后,无论加或不加MDK,ALK,Akt和BDNF表达量都明显下降,并且神经元轴突的生长长度和数量明显少于不加Bay11-7082组。[结论]1.在伴有神经浸润的结肠癌中,MDK的表达高于不伴有神经浸润的结肠癌,是上调表达的蛋白,并且高表达MDK预示着不良预后;2.重组MDK蛋白促进鼠背根神经节神经元轴突生长,并且最适浓度是800ng/ml;3.在肠癌细胞系与背根神经节三维共培养模型中,背根神经节轴突有向肠癌细胞系生长的趋势,加入重组MDK组与空白对照组相比生长指数差异更明显;并且MDK分泌量最少的SW620细胞组,外源加入重组MDK蛋白对背根神经节轴突生长的促进作用最明显;4.MDK通过增加ALK/PI3K/Akt信号通路及关键传导信号NF-κB的表达,促进神经元轴突生长;同时通过抑制关键传导信号NF-κB,施旺细胞分泌BDNF减少,导致MDK对神经元轴突生长的作用受到明显抑制。
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