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背景:结核病致病菌是结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis简称M.tb)。结核病预防有卡介苗(BCG),治疗有一线、二线抗结核化疗药物,但全球结核病疫情仍十分严重,它已成为世界公共卫生问题。结核病控制包括诊断、治疗、预防,随着分子生物学技术发展,M.tb抗原不断在结核病诊断和疫苗研制方面得到发现。
目的:本研究通过大肠杆菌表达M.tb融合蛋白810-H和蛋白Rv3618,810-H和Rv3618作为抗原,采用ELISA法检测结核患者、健康人、肺癌患者中抗810-H或Rv3618 IgG抗体,目的是评价两个抗原用于结核病血清学诊断的价值;融合蛋白810-H(抗原)与脱脂母牛分枝杆菌无细胞(佐剂)联合免疫小鼠对其T细胞亚群影响,探讨810-H是否可作为结核病亚单位疫苗的候选抗原和脱脂母牛分枝杆菌无细胞作为佐剂的理论依据。
方法:(1)PCR方法从M.tb H37Rv基因组中扩增Rv0475基因和Rv3618基因,Rv0475基因与载体PET-28a-810(本室构建表达融合蛋白810的载体,810是Ag85B和ESAT-6的融合蛋白),Rv3618基因与载体PET-28a连接,获得重组表达载体PET28a-810-Rv0475和PET28a-Rv3618,然后转化E.coli BL21(DE3)感受态。IPTG诱导重组E.coli表达重组蛋白810-HBHA(简称810-H)和Rv3618,810-H包涵体溶解上清经亲和层析、疏水层析,Rv3618包涵体溶解上清经离子交换层析、疏水层析:层析纯化蛋白经SDS-PAGE检测且纯的收集管合并、透析复性。(2)810-H和Rv3618作为抗原,ELISA检测来自108例肺结核、79例肺外结核、15例肺癌、59名PPD-健康人、50名PPD+健康人的血清中抗810-H和Rv3618的IgG抗体。(3)在微卡制备工艺基础上改进,建立稳定的脱脂母牛分枝杆菌无细胞(DMVCE)提取工艺。(4)以无细胞为佐剂,融合蛋白810-H为抗原免疫小鼠,试验分组:重组融合蛋白810-H(抗原组)和脱脂母牛分枝杆菌无细胞单独(佐剂组)或联合(疫苗组)单次免疫小鼠,以生理盐水免疫组作为对照,免疫后3周取血液和脾细胞,流式细胞术分析小鼠血液和脾脏T淋巴细胞亚群的变化。
结果:(1)IPTG诱导重组E.coli获得了大量以包涵体形式表达的重组蛋白810-HBHA(简称810-H)和Rv3618,包涵体溶解上清经层析获得了大量高纯度蛋白。(2)ELISA结果显示:PPD+健康人血清中抗810-H的IgG抗体的滴度高于肺结核、肺外结核、肺癌患者及PPD-健康人,其抗Rv3618 IgG抗体的滴度高于肺癌和PPD-健康人;对肺结核患者,810-H检测敏感度为42.6％(46/108),Rv3618检测敏感度为57.4％(62/108),两者比较差异有统计学意义(X2=4.74,P=0.029);对肺外结核患者,810-H检测敏感度29.1％(23/79),Rv3618检测敏感度51.9％(41/79),两者比较差异有显著性统计学意义(X2=8.51,P=0.004)。对PPD+健康人,810-H和Rv3618的IgG抗体阳性率分别为82％和80％;对PPD-健康人和肺癌,810-H和Rv3618检测特异度均大于90％。(3)脱脂母牛分枝杆菌无细胞主要由蛋白、多糖和核酸组成。(4)血液T细胞含量比较:抗原组、佐剂组、疫苗组CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+Foxp3+T、CD4+CD25+T、IL-4+CD4+T、IFN-γ+CD8+T和IL-4+CD8+T细胞含量与生理盐水对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);生理盐水对照组CD4+CD25+highT细胞含量高于疫苗组(P=0.037)、低于佐剂组(P=0.024),生理盐水对照组IFN-γ+CD4+T细胞含量低于佐剂组(P＜0.05)。脾脏T细胞含量比较:抗原组、佐剂组、疫苗组CD4+T、CD4+CD25+Foxp3+T、CD4+CD25+T与生理盐水对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05);佐剂组CD8+T、IFN-γ+CD8+T和IL-4+CD8+T细胞含量高于生理盐水对照组(P＜0.05),佐剂组CD4+CD25+highT、IFN-γ+CD4+T和IL-4+CD4+T细胞含量低于生理盐水对照组(P＜0.05);疫苗组IFN-γ+CD4+T细胞含量低于生理盐水对照组(P＜0.01);抗原组CD4+CD25+highT、IFN-γ+CD4+T、IL-4+CD4+T、IFN-γ+CD8+T、IL-4+CD8+T细胞含量低于生理盐水对照组(P＜0.05)。
结论:(1)810-H和Rv3618用于结核病血清学诊断敏感度均低于69％,与文献报道的抗原比较无明显优势;但因其用于PPD+健康人IgG抗体检测阳性率大于等于80％,提出假说:可能存在这样抗原可用于M.tb感染血清学诊断,为了验证此假说,扩大样本量进行进一步研究。若假设成立,将大大提高结核病感染率全国流调的回访率。(2)810-H和脱脂母牛分枝杆菌无细胞组合的亚单位疫苗免疫1次诱导的免疫应答不显著,需要加强免疫。(3)脱脂母牛分枝杆菌无细胞免疫小鼠,其脾细胞Th1、Th2细胞含量同时降低,而Tc1、Tc2细胞含量同时升高;而血液Th1、Th2细胞含量同时升高。这说明同一免疫原使血液和脾脏T淋巴细胞接受同一免疫原产生不同反应、同一免疫原可对多种T细胞亚群产生影响。