研究背景与目的肺纤维化是多种肺疾病发展到终末期的病理变化,是临床难治性疾病之一,以咳嗽、咯痰、呼吸困难为主要表现。其发病率有逐年上升之势,致死率较高,治疗预后不良,已成为备受关注的医学难题。本病发病机制复杂,与机体炎症及免疫调节相关的细胞和细胞因子存在密切关系,其中巨噬细胞发挥着重要作用。因此,干预巨噬细胞极化过程,调节肺纤维化免疫微环境,已经成为近年研究的热点。养肺活血方由江苏省名老中医王灿晖教授经验方加减而成,在临床具有良好的疗效。前期经过多项国家级、厅局级课题研究,运用循证医学、分子生物学、生物信息学、基因组学方法等对其作用机制进行了较为深入的探讨。研究表明,该方能够减轻肺纤维化动物模型的肺泡炎和纤维结缔组织增生,干预TGF-β1诱导的肺成纤维细胞表型转化,通过影响肺纤维化免疫炎症反应的多个环节,达到防治肺纤维化的目的。本研究在前期研究的基础上,首先梳理阐述了中医对肺纤维化的基本认识、治疗原则,对免疫炎症参与肺纤维化机制的现代医学研究文献进行综述,阐明干预巨噬细胞极化防治肺纤维化的理论基础。其次,以药物主要成分为着眼点,运用网络药理学的方法从更深层次揭示了该方的作用机制,结果显示养肺活血方能够通过多成分、多靶点、多效应、多途径发挥作用,而调节免疫炎症、调控细胞因子可能是其中关键机制。其后,围绕巨噬细胞极化开展了系列实验研究,基于肺纤维化大鼠模型、M1/M2巨噬细胞模型以及M2巨噬细胞和原代肺成纤维细胞的共培养模型,观察养肺活血方在体内外对巨噬细胞极化的影响,以冀通过本研究为临床治疗肺纤维化提供更多疗效可靠、机制清晰的中医药方法。研究方法1.通过文献整理及理论探讨,对肺纤维化的中医病因病机、治疗方法进行梳理归纳,并以此为据较深入地阐述临床验方养肺活血方治疗肺纤维化的理论基础和实验依据。同时,从免疫炎症的角度综述现代医学对肺纤维化发病机制的认识,重点探讨干预巨噬细胞极化、调控细胞因子、调节免疫炎症在肺纤维发生发展过程中的作用和意义,为后续网络药理学研究和体内外相关实验研究奠定基础。2.网络药理学分析:在中药系统药理学数据库和分析平台数据库筛选出药物活性成分和靶蛋白,在OMIM数据库和GeneCards数据库中检索肺纤维化相关的作用靶点,用Gifts算法计算靶点与肺纤维化的相关度,筛选出Gifts值≥30度的靶点。根据养肺活血方的药物活性成分靶点与肺纤维化的疾病靶点获取互作靶点,使用筛选到的互作靶点绘制药物-靶点网络图,并将筛选出的互作靶点输入String数据库,绘制可视化PPI图并分析其拓扑学性质,运用R语言对靶点进行GO富集和KEGG通路富集分析。3.动物实验:用博来霉素气管注射建立大鼠肺纤维化动物模型,设置空白组、地塞米松阳性对照组、养肺活血方高剂量组、中剂量组、低剂量组。除空白组外,各组分别灌胃给药,在第7天、14天、28天分批处死大鼠,取出肺组织样本,固定部分肺组织做HE和Masson染色,用Westernblot法检测肺组织iNOS和ARG1的表达。4.细胞实验:①将小鼠巨噬细胞RAW264.7用IFN-y+LPS诱导为M1型,IL-4诱导为M2型,用高、中、低剂量的养肺活血方含药血清进行干预,流式细胞术检测M1型和M2型细胞的主要表面标志物CD16/32、CD206,Westernblot法检测标志蛋白iNOS、ARG1的表达,ELISA法检测M1型巨噬细胞培养液中IL-1β、TNF-α的含量,M2型巨噬细胞中IL-10、TGF-β的含量。②将小鼠原代肺成纤维细胞和诱导为M2型的RAW264.7巨噬细胞在Transwell小室中建立共培养体系,用Westernblot法检测肺成纤维细胞α-SMA、COL-1、COL-3、TGF-β1、Smad3、p38蛋白的表达。二代转录组学基因测序法检测共培养体系中M2巨噬细胞RNA,用生物信息学方法分析其相关生物功能和信号通路,并且用荧光定量PCR验证相关差异基因。Westernblot法检测Notch信号通路上的靶点Notch1、NICD1、D114、RBP-Jκ蛋白表达。研究结果1.利用网络药理学方法,筛选出养肺活血方化合物靶点705个,去除重复后共获得126个化合物成分,共匹配到217个人类靶点。在OMIM数据库和GeneCards数据库获得4623个肺纤维化相关靶点,用String数据库进行蛋白质-蛋白质互作网络分析,该网络中共有183个节点,3450个互作关系,获得的关键靶点有TGF-β1、TNF、IL-6、IL-1β、CXCL8、MMP9、AKT1、MAPK8、MAPK1、VEGF-A等。通过GO富集分析,获得178个生物过程,养肺活血方治疗肺纤维化涉及的主要生物过程有核受体活性、细胞因子受体结合、细胞因子活性、激酶调节活动、受体配体活动等。通过KEGG通路分析,共获得184个靶点,分布在164条信号通路,主要涉及的相关信号通路有Notch信号通路、PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路等。2.养肺活血方能够改善肺纤维化模型大鼠的肺泡炎和纤维化程度,可在肺纤维化早期降低肺组织中M1型巨噬细胞标志物iNOS的表达、减轻炎症反应,在肺纤维化大鼠模型中后期降低M2巨噬细胞ARG1蛋白表达,干预巨噬细胞向M2细胞极化。3.养肺活血方含药血清能够抑制巨噬细胞M1表型标志物iNOS、CD16/32以及M2型巨噬细胞标志物CD206、ARG1的表达。同时,含药血清还可降低M1巨噬细胞模型培养液中IL-1β、TNF-α浓度,降低M2巨噬细胞模型培养液中IL-1β、TNF-α浓度,干预巨噬细胞极化亚型分泌促炎/抑炎细胞因子。4.①养肺活血方含药血清可以降低小鼠肺成纤维细胞-M2型巨噬细胞共培养体系中肺成纤维细胞α-SMA、COL-1、COL-3蛋白的表达,阻断肺成纤维细胞-肌成纤维细胞表型转化过程,并能降低肺成纤维细胞TGF-β/Smad信号通路TGF-β1、Smad3、p38蛋白表达。②对共培养体系中M2型巨噬细胞转录组二代测序结果显示,模型组和空白组相比共获得1433个差异表达基因,模型组和用药组相比共有481个差异基因。GO生物功能富集和KEGG通路分析显示养肺活血方对M2巨噬细胞的影响可涉及免疫系统过程、凋亡过程、细胞因子产生的负调控、细胞增殖、细胞运动、信号转导等众多生物过程。经qRT-PCR实验验证TNF、IRF4、CXCR4、CX3CR1、Notch1基因表达,提示上述测序结果可靠。③检测共培养体系中M2型巨噬细胞Notch信号通路基因靶点Notch1、NICD1、D114、RBP-Jκ,提示养肺活血方含药血清可以上调这些蛋白表达,这是该方调节巨噬细胞极化的可能机制之一。研究结论1.养肺活血方能够通过多成分、多靶点、多效应、多途径干预肺纤维化疾病进程。2.养肺活血方能够抑制肺纤维化模型大鼠巨噬细胞极化,改善大鼠肺纤维化程度。3.养肺活血方含药血清能够抑制M1和M2型巨噬细胞极化,影响肺纤维化免疫环境。4.养肺活血方含药血清能够调控M2巨噬细胞共培养诱导的肺成纤维细胞-肌成纤维细胞表型转化,其作用机制可能与干预TGF-β/Smad信号通路、Notch信号通路相关。