【摘 要】
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南极磷虾（Euphhausia superba）是一种生活在南极海域的甲壳类动物,是重要的战略性海洋生物资源。目前对南极磷虾安全性的研究主要集中在氟和砷等方面,对南极磷虾过敏的研究报道较少。如何预防和控制南极磷虾引起的食物过敏已成为一项紧迫的工作。本研究以脱壳南极磷虾肉为原料,通过盐溶液提取南极磷虾蛋白,并经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白;利用虾蟹过敏患者血清与南极磷虾蛋白的交叉
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南极磷虾（Euphhausia superba）是一种生活在南极海域的甲壳类动物,是重要的战略性海洋生物资源。目前对南极磷虾安全性的研究主要集中在氟和砷等方面,对南极磷虾过敏的研究报道较少。如何预防和控制南极磷虾引起的食物过敏已成为一项紧迫的工作。本研究以脱壳南极磷虾肉为原料,通过盐溶液提取南极磷虾蛋白,并经过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析蛋白;利用虾蟹过敏患者血清与南极磷虾蛋白的交叉反应,通过免疫印迹法（WB）筛选南极磷虾过敏原;使用高效液相色谱-串联质谱鉴定过敏蛋白一级结构;通过等电点沉淀、硫酸铵盐析、阴离子交换柱层析对主要过敏原进行分离纯化;采用SDS-PAGE及WB分析南极磷虾主要过敏原的耐热性及对模拟胃肠液的消化稳定性;构建南极磷虾原肌球蛋白-小鼠致敏模型,通过小鼠的过敏行为、免疫球蛋白E（Ig E）、致敏蛋白特异性Ig E、组胺及脾细胞因子等指标对致敏蛋白的致敏性进行评估。主要研究结果如下:（1）利用盐提法从南极磷虾肉中提取出肌浆蛋白（MS）和肌原纤维蛋白（MF）,SDS-PAGE电泳分析发现各蛋白条带丰富且分子量范围广。利用南极磷虾蛋白与虾蟹过敏患者血清的交叉免疫反应进行WB分析,结果显示至少有4个蛋白条带发生了阳性反应,其中免疫反应最强烈的蛋白分子量约为35 k Da,能够被所有的患者血清识别,经液质联用鉴定此过敏蛋白为南极磷虾原肌球蛋白（TM）。（2）利用等电点沉淀、硫酸铵盐析初步纯化蛋白,阴离子层析柱分离纯化蛋白。硫酸铵分级盐析纯化TM的最佳饱和度为50%;阴离子层析柱分离纯化后得到了纯度较高的TM,热稳定性好,能与虾蟹过敏患者血清发生强烈的免疫反应。（3）观察不同p H下蛋白溶解度,测得南极磷虾TM等电点为4.4;TM在40℃、60℃、80℃、100℃水浴锅中加热30 min后与4℃下存放的TM进行SDS-PAGE分析,结果显示TM未发生分解,说明TM具有较强的耐热性;利用猪胃蛋白酶配置模拟胃液,TM随着模拟胃液消化时间的延长,主条带分子量逐渐降低,最后稳定在33 k Da左右,并且分子量为15 k Da和12 k Da的降解片段含量逐渐增多且稳定存在;这些降解条带仍然能与过敏患者血清发生较强的免疫反应;利用猪胰蛋白酶配置模拟肠液,随着模拟肠液消化时间的延长,TM原始片段逐渐减少直至消失,最后完全降解成分子量更小的多肽;TM经肠液消化后其降解产物免疫活性大大降低。（4）利用生物信息学的方法对南极磷虾TM的亲水性、可塑性、抗原性等进行预测。预测结果显示,TM具有较高的亲水性和可塑性,发生β转角的氨基酸外露于抗体表面更易与抗原发生结合,最终认为氨基酸序列为101-107;120-126;140;148-150;159-165;178;180-189;212-224;231;234-236;248-257;266-270;273;275-278可能是TM潜在的抗原表位。构建南极磷虾原肌球蛋白-小鼠致敏模型,对小鼠进行腹腔注射给药,小鼠过敏表现证明南极磷虾TM具有较强致敏性。该论文有图19幅,表10个,参考文献100篇。
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