【摘 要】
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TNBC是乳腺癌的一种分子亚型,具有侵袭性高、进展迅速及易远处转移等特点[1]。近年来研究发现,TNBC中NOTCH信号通路被异常激活,而JAG1作为NOTCH信号通路的经典膜配体,对于肿瘤的发生发展具有重要作用[2]。课题组前期发现,高转移的TNBC细胞系MDA-MB-231衍生细胞株231B中JAG1表达显著上调,提示JAG1与TNBC远处转移存在一定联系。现有研究认为,远处转移灶中形成的转移
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TNBC是乳腺癌的一种分子亚型,具有侵袭性高、进展迅速及易远处转移等特点[1]。近年来研究发现,TNBC中NOTCH信号通路被异常激活,而JAG1作为NOTCH信号通路的经典膜配体,对于肿瘤的发生发展具有重要作用[2]。课题组前期发现,高转移的TNBC细胞系MDA-MB-231衍生细胞株231B中JAG1表达显著上调,提示JAG1与TNBC远处转移存在一定联系。现有研究认为,远处转移灶中形成的转移前生态位(PMN)对于肿瘤远处转移至关重要[3],而MSCs是PMN中关键的组成成分[4],且经典的NOTCH信号通路是由膜配体与膜受体直接接触激活的,那么TNBC中的JAG1是否对远处转移灶中MSCs有影响呢?这一作用是否通过外泌体介导所发挥的呢?现有相关研究尚未见报道。本研究以MEF细胞作为MSCs研究模型,采用JAG1重组蛋白及抑制剂DAPT分别处理肿瘤细胞,然后收取条件培养基,处理MEF细胞,探讨TNBC细胞中JAG1对于MSCs数量及分化的影响,并探究其具体的分子机制。本研究结果将探讨TNBC远处转移的潜在分子机制,并为TNBC患者转移的早期诊断提供潜在的分子靶点。第一部分:目的:探讨JAG1促进TNBC外泌体分泌的机制。方法:收取肿瘤细胞条件培养基(分组:231-Blank、231-r JAG1、231-DAPT、231B),超高速差速离心法提取肿瘤条件培养基中外泌体;外泌体表征(TEM、NTA、WB)以确定外泌体提取成功;NTA检测外泌体颗粒浓度;CCK-8检测DAPT及r JAG1对肿瘤细胞增殖的影响;q RT-PCR检测细胞内囊泡生成及释放相关分子RAB5、RAB7、RAB11A、RAB27A、RAB27B、RAB35、VAMP1、VAMP2、VAMP3、VAMP7、SNAP23的m RNA表达水平变化;WB检测MDA-MB-231细胞内外泌体生成及释放相关分子ALIX、ATG5、RAB11A的蛋白质表达水平变化;q RT-PCR检测各组MDA-MB-231细胞内及外泌体中JAG1相关lnc RNA SNHG16、MALAT1、DANCR的表达水平。结果:外泌体表征各项结果均符合外泌体特点,外泌体提取成功;粒径结果显示JAG1处理后外泌体浓度增加,且CCK-8结果显示DAPT与r JAG1处理对细胞增殖无影响;q RT-PCR及WB结果显示JAG1通过促进外泌体产生及释放分子ALIX、RAB11A、RAB35、ATG5的表达引起肿瘤外泌体数量增加,且引起MDA-MB-231细胞内及外泌体内lnc RNA MALAT1含量增加。结论:r JAG1通过ALIX、RAB11A、RAB35促进外泌体分泌。第二部分:目的:探究TNBC中JAG1对微环境中MSCs(增殖、招募、成骨分化、调控破骨相关指标、CAF指标、黏附分子)的影响。方法:以小鼠胚胎成纤维细胞MEF作为MSCs研究模型;r JAG1(50ng/ml)及DAPT(10μM)处理MDA-MB-231细胞,收取肿瘤条件培养基处理MEF细胞。荧光共聚焦验证MEF细胞摄取肿瘤外泌体;采用CCK-8、Transwell实验分别检测对MEF细胞增殖及招募的影响;ALP染色检测MEF成骨分化强度;q RT-PCR及WB检测MEF细胞成骨相关指标OPN、Runx2的表达水平;WB检测细胞内调控破骨相关分子OPG、RANKL及黏附相关分子CD106、CD54的蛋白表达水平;q RT-PCR及WB检测细胞内CAF表型相关分子α-SMA、Vimentin的m RNA及蛋白表达水平;胶原收缩实验检测MEF细胞收缩能力的变化。结果:CCK-8及Transwell结果显示r JAG1处理MDA-MB-231后促进MEF数量(增殖及招募);ALP染色结果显示各组间MEF早期成骨分化无显著变化;q RT-PCR及WB结果显示MDA-MB-231中JAG1对MEF成骨分化指标OPN、Runx2无显著影响;WB结果显示r JAG1处理MDA-MB-231的条件培养基促进MEF细胞破骨调控分子RANKL的表达;q RT-PCR及WB结果显示MDA-MB-231中JAG1促进CAF表型分子α-SMA、Vimentin表达;胶原收缩实验结果显示MDA-MB-231中JAG1促进MEF收缩能力;利用干扰质粒si MALAT1转染MEF以敲低MEF细胞内lnc RNA MALAT1表达;q RT-PCR验证敲低效果;WB验证敲低MALAT1后MEF细胞内调控破骨相关指标RANKL、OPG,及CAF表型相关指标α-SMA、Vimentin蛋白表达水平;胶原收缩实验验证MEF细胞收缩能力。结论:TNBC中JAG1能够促进MEF细胞的数量,同时促进MEF调控破骨分化能力及向CAF分化,而敲低MEF中MALAT1则抑制破骨分化诱导及CAF分化。
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