胰腺癌（pancreatic cancer,PC）是一种高度致命的恶性肿瘤,五年生存率小于6%,被称作“癌症之王”。只有20%的患者在确诊时可接受手术治疗。无法手术治疗的患者主要依赖化疗,但药物选择少且副作用严重。肿瘤免疫治疗为多种癌症治疗提供了希望。FDA已经批准针免疫检查点抑制剂、单克隆抗体、CAR-T（chimeric antigen receptor T）细胞疗法等免疫治疗手段,并成功应用于黑色素瘤、胃癌、宫颈癌和弥漫性大B细胞淋巴瘤等多种癌症的治疗。然而诸多免疫疗法在胰腺癌中收益不佳。阻碍胰腺癌免疫治疗的最大障碍是胰腺癌的肿瘤微环境（tumor microenvironment,TME）。胰腺癌TME主要特点为:T细胞、NK细胞浸润不足;免疫抑制性细胞大量浸润;免疫抑制因子抑制T细胞、NK细胞,最终在胰腺癌中形成了以失能甚至缺乏T细胞介导的适应性免疫应答为特点的TME,是一种典型的免疫学意义上的“冷”肿瘤。作为经典免疫刺激剂,Toll样受体9（Toll-like receptor 9,TLR9）激动剂可激活树突状细胞（Dendritic Cells,DCs）内体膜上TLR9,继而活化IRF7和NF-κB两条主要的TLR9信号转导通路。从而介导IFN-α的快速产生,激活NK细胞,阻断免疫抑制,促进辅助性T细胞1（helper T lymphocyte 1,Th1）和CD8+T细胞向肿瘤归巢,同时刺激DCs上调细胞表面共刺激分子CD80、CD86、CD40的表达,促进肿瘤特异性CD8+T细胞的产生和活化。研究表明,TLR9激动剂CpG寡核苷酸（CpG oligonucleotide、CpG ODN）、lefitolimod等不仅可以抑制乳腺癌、黑色素瘤、头颈部鳞状细胞癌、小细胞肺癌等多种癌症的发生发展,还可以抑制远端肿瘤的进展。TLR9激动剂具有激活机体免疫、逆转肿瘤微环境的免疫学特性,理论上可成为治疗典型“冷”肿瘤—胰腺癌的有效策略。然而研究发现应用TLR9激动剂治疗组与对照组相比,小鼠生存期未见明显收益,无法满足治疗需求。基于癌症-免疫循环理念,本文进一步探究原因。实现T细胞有效杀伤肿瘤,需要在肿瘤微环境中形成包括:T细胞启动和激活;T细胞向肿瘤趋化;T细胞浸润肿瘤;T细胞识别肿瘤细胞;T细胞杀伤肿瘤细胞;释放肿瘤抗原;递呈肿瘤抗原等七步在内的闭环抗肿瘤免疫反应。研究表明,胰腺癌细胞通过自噬降低自身细胞表面主要组织相容性复合体Ⅰ（MHC Ⅰ）类分子的表达。T细胞只能识别由MHC Ⅰ类分子递呈的肿瘤抗原,MHCⅠ类分子低表达阻断了 T细胞对胰腺癌细胞的识别。因此,胰腺癌肿瘤微环境中存在T细胞浸润不足和T细胞无法识别肿瘤细胞两个环节的缺失。应用TLR9激动剂仅恢复T细胞向肿瘤浸润环节,所以无法阻止胰腺癌细胞破坏癌症-免疫循环。磷酸氯喹（CQP）作为自噬抑制剂,可抑制自噬小体与溶酶体的融合,阻断细胞自噬过程,具有恢复胰腺癌细胞MHCⅠ类分子表达的作用。在胰腺癌中联合应用CQP与CpG ODN实现自噬与TLR9的协同调控或许可以发挥良好疗效。综上所述,TLR9激动剂单药应用无法在胰腺癌TME重塑完整癌症-免疫循环,本文进一步提出TLR9和自噬协同调控策略来恢复胰腺癌中癌症-免疫循环。本文设计制备了可以靶向胰腺癌并级联释药的纳米粒—包裹铁蛋白的DNA纳米笼（ferritin in DNA-nanocage,Fe@DN）。Fe@DN 可在肿瘤部位响应高浓度 H2O2 恢复 DNAzyme 8-17活性,裂解DNA笼释放铁蛋白,具有CpG ODN活性的DNA笼可激活DCsTLR9,铁蛋白负载CQP靶向肿瘤细胞释药,抑制肿瘤细胞自噬。本文通过体内外实验探究了 Fe@DN协同调控自噬和TLR9的策略应用于胰腺癌的疗效及机制。体外实验验证了 Fe@DN可激活DCs,提高DCs的表面共刺激分子表达及Ⅰ型干扰素分泌,同时上调胰腺癌细胞表面MHCⅠ类分子表达,两方面的协同作用最终提高荷瘤小鼠淋巴细胞对胰腺癌细胞的杀伤效率。继而使用原位荷瘤小鼠评价疗效,与单独使用CpG ODN或CQP相比,Fe@DN的抑瘤效果更加显著,可以明显延长小鼠的生存期,显著增强肿瘤微环境中DCs和CD8+T细胞的浸润,上调胰腺癌细胞MHC Ⅰ类分子表达,提高荷瘤小鼠TNF-α、IL-12、IFN-γ等促炎因子的分泌,实现肿瘤微环境由“冷”转“热”,同时Fe@DN具有良好体内安全性。Fe@DN可实现自噬和TLR9的协同调控策略,显示出良好疗效,为胰腺癌免疫治疗提供了新的思路和方法。方法Fe@DN的制备与表征:1.通过DNA模块化组装及铁蛋白pH变复性法构建Fe@DN。2.通过透射电子显微镜（TEM）、马尔文粒度分析仪、微量蛋白浓度检测试剂盒、紫外分光光度法对Fe@DN形态、粒径、电位、包封率进行测定。3.通过马尔文粒度分析仪,溶血实验评价Fe@DN体外稳定性和安全性。4.通过微量蛋白浓度检测试剂盒和紫外分光光度计进行Fe@DN体外释药行为评价。Fe@DN的体外功能验证及机制探究:1.提取并诱导小鼠骨髓源DCs（BMDCs）,并通过流式细胞术进行纯度检测。2.体外利用Fe@DN处理小鼠BMDCs,通过流式细胞术和ELISA检测DCs表面CD80、CD86、CD40等共刺激分子的表达及Ⅰ型干扰素的分泌。3.体外利用Fe@DN处理PANC-O2细胞,利用Western-Blot技术检测PANC-O2细胞MHCⅠ类分子表达水平。4.体外利用Fe@DN处理PANC-O2细胞,利用CCK8法检测PANC-O2细胞增殖情况。5.体外利用Fe@DN处理PANC-O2细胞,利用Annexin V-7AAD法检测PANC-O2细胞凋亡情况。6.体外将荷瘤小鼠脾淋巴细胞与PANC-O2细胞、Fe@DN共孵育,利用CFSE-7AAD法检测小鼠脾淋巴细胞对PANC-02细胞杀伤情况。Fe@DN的体内药效学评价及机制探究:1.建立PANC-02原位胰腺癌荷瘤模型,尾静脉注射Fe@DN,利用小动物活体成像技术观察Fe@DN体内分布和肿瘤进展;统计小鼠生存期;利用免疫荧光技术观察各治疗组小鼠CD8+T细胞和DCs在肿瘤内的浸润情况;利用免疫组化技术观察小鼠胰腺癌细胞表面MHC Ⅰ类分子的表达情况;利用ELISA检测小鼠血清TNF-α、IL-12、IFN-γ等的浓度;利用H＆E染色观察Fe@DN的安全性。结果Fe@DN的制备与表征:1.成功构建Fe@DN。2.Fe@DN形态清晰、分散性良好,平均粒径为81.75±2.05 nm、Zeta电势为-24.59±3.07 mV同时包封率适宜。3.Fe@DN在体外保持稳定且溶血率小于5%。4.Fe@DN具有良好的体外释药行为和释药效率。Fe@DN的体外功能验证及机制探究:1.制得纯度＞90%的小鼠BMDCs。2.体外利用Fe@DN处理BMDCs后,DCs表面CD80、CD86、CD40等共刺激分子的表达及Ⅰ型干扰素的分泌明显升高。3.Fe@DN可上调PANC-02细胞MHC Ⅰ类分子表达水平。4.Fe@DN可有效抑制PANC-02细胞增殖。5.Fe@DN可以促进PANC-02细胞凋亡。6.Fe@DN可明显提高荷瘤小鼠脾淋巴细胞对PANC-02细胞杀伤能力。Fe@DN的体内药效学评价及机制探究:1.Fe@DN具有肿瘤靶向性,可明显延长小鼠生存期,控制小鼠肿瘤进展,增加小鼠肿瘤内CD8+T细胞与DCs的浸润,恢复小鼠胰腺癌细胞表面MHC Ⅰ类分子的表达,提高小鼠TNF-α、IL-12、IFN-γ的分泌,同时对小鼠心、肝、脾、肺、肾等器官无损伤。结论1.Fe@DN具有肿瘤高浓度H2O2和溶酶体酸性环境双重响应释药能力,同时可具有良好肿瘤靶向性能,实现了 CpG ODN和CQP分级靶向递送。2.Fe@DN在体外可有效激活DCs,同时抑制胰腺癌细胞自噬上调MHC Ⅰ类分子水平,有效产生协同作用,促进荷瘤小鼠淋巴细胞对PANC-02细胞的杀伤。3.借助Fe@DN实现的自噬和TLR9的协同调控策略在荷瘤小鼠肿瘤微环境中恢复完整癌症-免疫循环,明显抑制小鼠肿瘤进展,延长小鼠生存期,显示出良好的胰腺癌治疗效果。