程序性坏死是一种受到调控并引起炎症的细胞死亡形式。与细胞凋亡相似,坏死可由多种信号诱导,包括刺激TNFR、TLR3、TLR4和TCR的信号。程序性坏死信号涉及蛋白激酶RIPK1和RIPK3的激活,随之磷酸化其下游底物MLKL形成同源寡聚体,最终导致细胞破裂、死亡。前期的实验表明,在用蛋白合成抑制剂CHX处理的肠道上皮细胞IEC和MEF中,坏死激酶的稳定性特别是RIPK3和MLKL的蛋白质水平下降。RIPK3是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,在应答免疫反应和维持组织内稳态的过程中作为炎症和程序性坏死信号的关键调控分子。MLKL是RIPK3的下游靶点,在坏死途径中与RIPK3相互作用。而RIPK3的表达可以通过转录和转录后机制来调节。据报道,部分泛素化的RIPK3蛋白可以被E3泛素连接酶CHIP,PELI1降解以及去泛素化酶A20修饰。在本课题中,我们通过筛选一系列具有修饰功能并且与介导RIPK3降解相关的TRIM分子,确认发现TRIM11是能够促进RIPK3降解的候选蛋白之一,随后进一步研究了TRIM11对坏死激酶的降解效率,发现随着TRIM11转染梯度的增加过表达的RIPK3和MLKL蛋白会逐渐减少,但RIPK1的降解不太明显。免疫共沉淀分析显示TRIM11与RIPK3有相互作用,而与MLKL无相互作用。我们还发现在TRIM11稳定表达的L929细胞中,内源性的RIPK3也会被过表达的TRIM11富集。我们还将TRIM11行使E3泛素连接酶功能结构域中的关键位点突变,以确定TRIM11是否作为E3泛素连接酶对RIPK3的稳定产生作用,结果发现失活的突变体丧失了对RIPK3的降解能力。接下来我们进行体外泛素化实验验证TRIM11在RIPK3泛素化中的作用,结果发现TRIM11能够促进RIPK3蛋白的泛素化。通常蛋白质的降解依赖于蛋白酶体、溶酶体和自噬体三种途径,因此我们使用了不同降解途径的抑制剂来阻止RIPK3的降解。最后发现PI3K/VPS34的抑制剂3-MA和SAR405对RIPK3的降解在一定浓度梯度起抑制作用。随后,我们利用CRISPR-CAS9技术制备了TRIM11 KO HT-29细胞,以进一步评估TRIM11在RIPK3降解中的作用。在TRIM11 KO HT-29细胞中,虽然p62在不含血清和氨基酸的EBSS诱导产生自噬后含量下降,但RIPK3的降解得到了显著改善。SAR405能够阻断p62和RIPK3的降解,这也进一步支持了TRIM11介导RIPK3的降解是通过自噬途径的观点。此外,在用TNFα、BV-6、Z-VAD诱导的TRIM11 KO HT-29细胞坏死后,通过试剂盒检测坏死发现TRIM11KO细胞比WT细胞更加敏感,引起更多的细胞死亡。与此同时,用PI染色观察与试剂盒检测坏死结果显示TRIM11稳定表达的L929细胞相对于WT与稳转TRIM11突变的细胞来说,对TNFα,Z-VAD刺激引起的坏死起一定的保护作用。综上所述,本课题证明了TRIM11作为E3泛素连接酶参与细胞程序性坏死过程中RIPK3的泛素化和降解。尽管之前有报道称TRIM11与错误折叠的poly Q和AIM2的降解有关,但其是否在程序性坏死过程中起作用尚未明确。我们的数据结果表明,TRIM11可能对RIPK3进行K48位多聚泛素化标记后,被受体p62介导的选择性自噬途径靶向识别并降解。在这里,我们的研究发现了在细胞程序性坏死过程中对调控RIPK3降解的新分子,并促进了程序性坏死与自噬之间的联系,为相关治疗手段提供了新的思路。