论文部分内容阅读
坦布苏病毒（Tembusuvirus,TMUV）属于黄病毒科（Flaviviridae）,黄病毒属（Flavivirus）,主要存在于东南亚地区的蚊虫媒介中。病毒感染家禽可引起严重的产蛋下降和中枢神经系统症状,自2010年4月在中国南方部分地区养鸭场爆发以来,已蔓延至我国大部分家禽养殖区域,严重威胁着水禽养殖业。及时了解和掌握该病的发生和流行情况,开展疫苗的研究对有效防治该病具有重要的意义。本研究首先以浓缩的全病毒免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术获得两株能够稳定分泌抗鸭坦布苏病毒特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,产生的单克隆抗体可特异性地识别病毒E蛋白白。以此为基础,建立了阻断ELISA方法用于抗坦布苏病毒抗体的检测。该方法特异性高、敏感性强,与蚀斑减数中和试验符合率高达98.28%,同时具有良好的相关性（r2=0.7998,P<0.001）。对2009～2015年间我国部分地区水禽养殖场的血清样本进行抗体检测和病原分离鉴定,结果表明近年来部分养殖场仍然存在不同程度的病毒感染。为进一步开展病毒疫苗研究,本研究以坦布苏病毒JXSP株为对象,通过连续传代使其能稳定适应BHK-21细胞,以低代次毒株为抗原制备了矿物油乳剂灭活疫苗。雏鸭首次免疫后对强毒感染的保护指数可达87%,组织脏器载毒量显著低于未免疫鸭;二次免疫则能完全抵抗病毒感染。产蛋鸭经二次免疫后可有效抵抗强毒的攻击。阻断ELISA检测结果显示,蛋鸭群首免21d后抗体转阳率为97%（39/40）,二免后抗体水平显著上升,并能持续4个月以上。随着传代次数的增加,病毒对细胞的适应性明显增强,表现为感染细胞病变进程逐渐加快,病毒滴度不断升高;另一方面,病毒对试验鸭的致病性明显下降。动物感染试验结果表明,第150代细胞适应毒感染雏鸭后不引发明显的临床症状,感染雏鸭各组织脏器载毒量显著低于强毒组;高代次毒株JXSP2-310已充分致弱,仅在感染雏鸭的脾脏组织中检测到少量病毒,易感雏鸭体内连续传代无毒力返强现象。以105PFU//只的剂量免疫蛋鸭10d后攻击强毒,保护率可达100%,表明弱毒株JXSP2-310 具备非常好的免疫原性,可以作为弱毒疫苗的候选株。基因组序列分析显示,与强毒株JXSP2-4相比,高代次弱毒株JXSP2-310全基因组共产生了 41个核苷酸位点的变异,导致23个氨基酸突变。为深入探讨病毒细胞适应及其致弱的分子机制,本研究对坦布苏病毒原代毒株JXSP2-1以及高代次细胞适应毒株（JXSP2-150、JXSP2-280及JXSP2-310）的全基因组进行了深度测序并对其单核苷酸变异多态性进行分析。结果表明,JXSP2-1具备准种特征,但SNP位点数目较少,且变异频率低。而高代次适应毒株的SNP位点数目显著增加,变异频率也显著升高。准种多样性指数统计学分析结果显示,高代次毒株的香农熵与辛普森指数均显著高于原代毒株,表明鸭坦布苏病毒在细胞上传代适应过程中,其准种多样性不断增加。通过蚀斑克隆技术,挑选获得了病毒准种优势突变株,为后续致弱机制的研究奠定基础。为进一步揭示病毒基因突变与毒力变化的相关性,本研究采用反向遗传操作技术获得了鸭坦布苏病毒亲本拯救毒株JXSP-RV,并以构建的JXSP2-4感染性cDNA克隆为骨架,将弱毒株JXSP2310E蛋白基因置换到JXSP2-4相应区域,拯救获得嵌合毒株JXSP-310E。细胞感染试验表明,嵌合毒株在BHK-21细胞上的增殖能力显著高于亲本拯救毒株。动物感染试验表明,嵌合毒株接种雏鸭与3周龄BALB/c小鼠后不能引起明显的临床症状,且感染雏鸭血液、脑及心脏组织中病毒含量显著低于亲本拯救毒株组。由此推测,鸭坦布苏病毒E蛋白基因的氨基酸变异是影响病毒增殖能力和病毒毒力的关键因素。综上所述,本研究建立了鸭坦布苏病毒阻断ELISA抗体检测方法,成功制备了病毒细胞灭活苗,筛选获得了完全致弱的高代次细胞适应毒株,同时发现病毒细胞适应过程中准种多样性的显著增加并确定E蛋白上氨基酸位点的变异与病毒的适应性及致病性密切相关。这些结果为鸭坦苏病毒的诊断预防提供了有力工具,为病毒致病分子机制的研究提供参考。