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目的:本实验拟通过高糖(HG)高脂(PA)诱导人脐静脉内皮细胞(HUVECs)胰岛素抵抗(IR),探究PPARγ1 K77位SUMO化变化,并构建Ad-PIAS1-RNAi腺病毒载体,感染到IR的HUVECs中,观察PPARγ1 K77SUMO化是否介导了HUVECs IR的发生并探讨其可能的机制。方法:(1)腺病毒(Adenovirus,Ad)载体的构建。GenBank中查找人源PPARγ和PIAS1基因的mRNA序列,设计引物序列,RT-PCR扩增PPARγ,PIAS1的全长片段,按Ad包装试剂盒操作步骤获得重组腺病毒载体Ad-PIAS1-RNAi,将Ad感染到HEK293T细胞中,扩增,纯化,最后检测Ad滴度。(2)内皮细胞IR模型的建立。首先利用含不同浓度葡萄糖(5.5 mmol/L、11 mmol/L、22mmol/L、33 mmol/L、44mmol/Lglucose)培养基孵育HUVECs48h,筛选最佳糖浓度;其次用含不同浓度棕榈酸(0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5mmol/L、1.0mmol/L Palmitic acid,PA)培养基孵育HUVECs48h筛选最佳PA浓度;最后用最佳糖浓度、最佳PA浓度培养HUVECs不同时间(0h、12h、24h、48h)后,用胰岛素(100 nmol/L)刺激细胞30min,分别测定各组上清液中NO和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)水平,细胞中p-Akt的表达水平,以确保内皮细胞IR模型的成功建立。(3)流式细胞仪检测HUVECs IR时细胞活性氧ROS的变化;Western blotting检测HUVECs IR时p-IKK,IKK,核共辅助抑制因子(NcoR)水平;通过免疫沉淀法(CoIP)检测HUVECs IR时PPARγSUMO-1水平改变以及PIAS1与IKK相互作用。激光共聚焦(Confocal)检测NcoR和PPARγ1的细胞内亚定位情况。(4)HUVECs诱导成胰岛素抵抗后用最佳浓度腺病毒Ad-PIAS1-RNAi感染细胞,检测感染腺病毒载体后培养基上清中NO和AngⅡ的水平;Western blotting法检测p-Akt蛋白表达水平。结果:(1)高糖高脂诱导内皮细胞24h后,培养基上清中NO水平明显下降,AngⅡ水平却明显上升,p-Akt的表达水平明显下降,表明HUVECs的IR模型构建成功。(2)HUVECs IR模型建立后,IR组细胞ROS较Ctrl组明显增多,p-IKK和NcoR表达水平显著增多;CoIP结果表明,IR组的PPARγ1发生SUMO化水平较Ctrl组显著上升,并且明显存在PIAS1与IKK相互作用;Confocal结果进一步显示,IR组的NcoR与PPARγ1结合程度较Ctrl组明显。(3)高糖高脂诱导IR后加Ad-PIAS1-RNAi处理48h,可改善高糖高脂诱导的IR程度。结论:PPARγ1 K77 SUMO化介导了高糖高脂诱导的血管内皮细胞发生胰岛素抵抗;其机制可能是高糖高脂刺激活性氧(ROS)大量产生,激活IKK,触发IKK与PIAS1相互作用,从而导致PPARγ1K77发生过SUMO-1化;过SUMO-1化的PPARγ1进一步富集NcoR,使PPARγ1处于转录抑制状态,最终导致IR。