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丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)属于黄病毒科，世界上有将近1.75亿的HCV感染者，我国抗HCV阳性检出率约达3%，预计HCV感染者在三千万左右。HCV感染可进一步发展成慢性丙型肝炎(Chronic hepatitis C,CHC)，甚至肝纤维化和肝细胞癌(Hepatacellular carcinoma,HCC)，危害极大。干扰素-(Interferon-,IFN-)治疗慢性丙型肝炎开始于1986年，之后与利巴韦林(Ribavirin)联合使用，显著提高了HCV病毒血症的清除效果并下调患者治疗后的丙型肝炎复发率。在近年新发展的HCV蛋白酶抑制剂疗法中，使用利巴韦林也是显著提高应答率的必要条件。虽然大量的临床研究已证明利巴韦林在优化治疗中的重要性，然而对其抗病毒机理仍需深入探讨。已经证明，利巴韦林单独治疗并不能清除HCV感染，但能增加患者对IFN-的应答。由于IFN-的抗病毒效应是通过对分裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activatedprotein kinase,MAPK)及信号转导与转录激活因子(Signal transducer and activator oftranscription,STAT)途径中的信号分子磷酸化进行调节并诱导抗病毒基因表达实现的，因此我们认为利巴韦林可能通过影响细胞内相关信号途径而发挥其生物学效应。本研究目的是探讨利巴韦林如何调节MAPK及STAT途径信号转导从而发挥抗HCV效应。以体外培养的感染性HCV(Cell culture-derived HCV, HCVcc)模拟HCV感染，采用流式细胞术、Western blotting和实时定量PCR等方法探讨利巴韦林对人肝癌细胞内ERK、p38MAPK和STAT途径各激酶的调节、HCV复制及抗病毒基因表达的影响。一利巴韦林对MAPK途径的影响不同剂量（0、1、5、10、20、100μg/ml）利巴韦林分别处理Huh7.5.1细胞，24h后收集样品，Western blotting检测MAPK途径激酶的磷酸化水平。研究发现，1μg/ml到100μg/ml利巴韦林能够抑制Raf、MEK和ERK的磷酸化，而呈剂量依赖性上调p38MAPK的磷酸化。20μg/ml利巴韦林分别处理Huh7.5.1细胞12h、48h、72h、96h，裂解细胞收集样品。Western blotting检测发现，利巴韦林抑制Raf、MEK和ERK的磷酸化；p38MAPK磷酸化水平在利巴韦林处理的12h、48h、96h升高，而72h时降低。此外，1μM U0126预处理可明显下调20μg/ml利巴韦林诱导的ERK磷酸化,表明利巴韦林特异性调节ERK。二利巴韦林对STAT途径的影响进一步研究利巴韦林对STAT途径的影响，包括上游激酶Tyk2、Jak1和下游激酶STAT1、STAT3。结果显示，5-100μg/ml利巴韦林处理24h可下调Tyk2磷酸化水平；10、20μg/ml利巴韦林上调Jak1磷酸化；利巴韦林下调STAT1磷酸化而上调STAT3磷酸化。激酶级联反应动力学显示，Tyk2磷酸化水平在20μg/ml利巴韦林处理48h、72h、96h下调；Jak1磷酸化水平在12h上调；STAT3磷酸化水平在12h、48h和96h升高，而在72h降低；STAT1磷酸化水平在除72h外的其他处理时间点都降低。1μM JAK Inhibitor预处理抑制利巴韦林诱导的STAT3磷酸化，表明利巴韦林特异性上调STAT3磷酸化。三IFN-对利巴韦林调节MAPK和STAT途径的影响由于利巴韦林联合干扰素具有显著的临床治疗效果，本研究探讨IFN-对利巴韦林引发MAPK和STAT途径的影响。结果显示,利巴韦林联合IFN-处理48h协同下调ERK磷酸化，并协同上调p38MAPK磷酸化。IFN-联合利巴韦林处理72h则协同下调STAT3和p38MAPK磷酸化。与利巴韦林抑制STAT1磷酸化相反，IFN-不仅促进STAT1的磷酸化，而且增强STAT1的表达。因此，IFN-与利巴韦林协同调节ERK、p38MAPK和STAT3。四HCVcc感染影响利巴韦林对MAPK和STAT途径的调节研究HCVcc感染对利巴韦林引发信号途径的影响。结果显示，HCVcc感染时，利巴韦林剂量依赖性下调ERK、p38MAPK与Tyk2的磷酸化水平，微弱下调STAT1磷酸化水平并剂量依赖性上调STAT3的磷酸化水平。相反，HCVcc上调ERK与p38MAPK的磷酸化水平。表明HCVcc感染抑制利巴韦林引发的信号途径。五利巴韦林抑制HCV复制并诱导抗病毒基因不同剂量利巴韦林处理HCVcc感染的Huh7.5.1细胞。研究表明，利巴韦林剂量依赖性抑制HCV RNA复制以及HCV结构蛋白E2和非结构NS3的表达。80μg/ml利巴韦林显著抑制HCV RNA的复制和HCV E2、NS3蛋白的表达。HCVcc感染时利巴韦林诱导抗病毒基因，且80μg/ml利巴韦林明显上调干扰素调节因子9（Interferonregulatory factor9, IRF9）和干扰素刺激基因15（Interferon-stimulated gene15, ISG15）的mRNA水平。因此，利巴韦林可抑制HCV复制并诱导抗病毒基因的表达。六利巴韦林联合IFN-协同抑制HCV复制5、10、20U/ml IFN-联合利巴韦林比1μg/ml或5μg/ml利巴韦林单独处理更显著抑制HCV复制，并且联合处理时HCV E2和NS3蛋白的表达也被明显抑制。表明利巴韦林和IFN-协同抑制HCV复制。然而，在HCVcc感染时，利巴韦林和IFN-对IRF9和ISG15的诱导表达未表现出协同作用。综上所述：利巴韦林调控MAPK和STAT途径信号转导从而介导抗HCV效应。