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第一部分:大鼠跟腱组织自然老化模型的构建和鉴定目的:构建大鼠跟腱组织自然老化模型并鉴定自然老化过程中跟腱组织特征的多时空变化,为研究跟腱老化的细胞与分子机制提供良好的模型。方法:使用年龄分别为2、4、8和20个月(Month,M)的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠,2M和4M为年轻组,8M为成熟组,20M为老化组,2M~8M为成熟过程,8M~20M为老化过程。通过一系列组织学染色(H&E、茜素红和阿利新蓝)观察并评估肌腱组织纵切面中的细胞数量和细胞核形态变化。使用Western blotting(WB)检测肌腱组织内细胞的衰老标志物P16INK4a和P53的表达。通过X射线和CT观察肌腱组织老化过程中的影像学变化。使用实时定量逆转录聚合酶链反应(q RT-PCR)和透射电子显微镜(TEM)分别评估跟腱组织的组成成分和胶原纤维直径的变化。结果:在跟腱组织的成熟(2M~8M)和老化(8M~20M)过程中,H&E染色发现,随着年龄增长,细胞的数量逐渐减少和细胞核变细长。跟腱组织内细胞的衰老标志物P16INK4a和P53表达上升,提示细胞渐进衰老。此外,组织学染色观察到骨-软骨样细胞包围的异位骨化开始在4M组的跟腱组织中出现,随着年龄增长,异位骨化区域逐渐增大。影像学层面也观察到异位骨化开始在4M组中出现,随着年龄增长,异位骨化体积和密度均呈上升趋势。跟腱组织的组成成分(Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、核心蛋白聚糖、双糖链蛋白多糖、聚集蛋白聚糖和纤调蛋白聚糖)的表达水平在成熟期间呈上升趋势,在老化期均呈下降趋势。胶原纤维直径大小在成熟期间呈上升趋势,在老化期未见明显变化。结论:随着年龄增长,跟腱组织内细胞的数量减少、细胞核变细长、细胞也渐进衰老,同时,异位骨化体积和密度均也逐渐上升,推测细胞衰老变化和异位骨化之间相互影响,并推进跟腱组织老化的进程。同时,上述动态细胞与组织学的变化可能是影响跟腱组织的组成成分和胶原纤维直径变化的重要始发因素之一。总之,20M组跟腱组织表现出明显细胞与组织学的老化改变,表明跟腱组织自然老化可作为肌腱老化的理想模型。老化过程中观察到的动态细胞与组织学的变化也为更好地研究跟腱组织年龄相关性变化的机制提供重要的潜在方向。第二部分:肌腱干细胞衰老相关的细胞功能和分子变化在肌腱老化中的作用目的:探索肌腱干细胞(Tendon stem/progenitor cells,TSPCs)衰老过程中细胞功能和分子变化在肌腱老化中的作用。方法:选择年龄为4M的大鼠为年轻组,20M的大鼠为衰老组,分别分离和培养年轻TSPCs和衰老TSPCs。采用4D非标记(4D Label-free)定量蛋白组学检测年轻和衰老TSPCs相关蛋白的表达变化。采用q RT-PCR、WB和SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色实验评估并比较两组TSPCs衰老状态。通过Alamar blue、克隆形成能力和体外迁移实验分别评估并比较两组TSPCs增殖能力、克隆形成能力和迁移能力的变化。通过成骨、成软骨诱导分化实验、q RT-PCR、细胞免疫荧光实验分别评估并比较两组TSPCs的成骨分化能力、成软骨分化能力和成肌腱分化能力的变化。结果:年轻和衰老TSPCs定量蛋白组学的结果显示,共检测到5552种蛋白,有813种蛋白发生1.2倍以上的变化,其中,上升的蛋白有386种,下降的蛋白有427种。基因本体(Gene Ontology,GO)分析发现差异蛋白基因主要富集在增殖、迁移、分化和衰老等功能方面。同时,和年轻TSPCs相比,衰老TSPCs的衰老标志物(P16INK4a、P53和SA-β-gal阳性细胞)表达上升,呈现衰老表型。和年轻TSPCs相比,衰老TSPCs的体外增殖速度下降;衰老TSPCs形成的克隆样细胞团的数量减少,定量分析显示衰老TSPCs的克隆形成效率也降低;衰老TSPCs的体外迁移速度也下降。和年轻TSPCs相比,衰老TSPCs的成肌腱分化相关标志物Col1A1和Col3A1的表达下降;衰老TSPCs中可观察到更多的Alizarin Red S染色阳性钙结节,半定量结果表明衰老TSPCs中钙结合的Alizarin Red S信号强度更高;两组TSPCs均可形成了三维的小球团,但衰老TSPCs所形成的小球团体积更大。结论:衰老组肌腱来源的TSPCs呈现衰老表型,且衰老TSPCs的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和成肌腱分化能力下降,而成骨分化能力和成软骨分化能力上升,与上述老化肌腱的年龄相关性变化之间呈现密切的正向相关性,提示TSPCs衰老过程中细胞功能和分子变化可能在肌腱老化中发挥着非常重要的作用。第三部分:AMPK-mTOR信号通路在肌腱干细胞衰老中的作用研究目的:探索AMPK-mTOR信号通路在肌腱干细胞衰老中的作用。方法:对年轻和衰老TSPCs定量蛋白组学差异蛋白采用KEGG PATHYWAY分析评估AMPK-mTOR信号通路的活性变化。采用WB实验进一步验证年轻和衰老TSPCs中AMPK-mTOR信号通路的活性变化。采用AMPK分子的特异性激活剂AICAR和抑制剂Compound C干预衰老TSPCs。然后,采用WB、q RT-PCR和SA-β-半乳糖苷酶染色实验评估不同组TSPCs的衰老状态和AMPK-mTOR信号通路活性变化。采用Alamar blue、克隆形成能力、体外迁移、q RT-PCR和细胞免疫荧光实验评估不同组TSPCs增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和成肌腱分化能力的变化,进一步验证TSPCs衰老状态和细胞功能变化是否通过AMPKmTOR信号通路发挥作用。结果:KEGG PATHYWAY分析表明AMPK-mTOR信号通路可能参与调控TSPCs衰老进程。同时,WB实验结果进一步验证衰老TSPCs的p-AMPK的蛋白表达下降、p-mTOR和p-S6K1的蛋白表达升高,衰老TSPCs的AMPK-mTOR信号通路活性下降。同时,衰老TSPCs在AICAR的作用下,p-AMPK的蛋白表达上升、p-mTOR和p-S6K1的蛋白表达下降,衰老TSPCs的AMPK-mTOR信号通路活性上升;衰老TSPCs的衰老标志物(P16INK4a、P53和SA-β-gal阳性细胞)表达下降;衰老TSPCs的体外增殖速度上升;衰老TSPCs形成的克隆样细胞团的数量增加,定量结果表明衰老TSPCs的克隆形成效率也更高;衰老TSPCs的体外迁移速度上升;衰老TSPCs的成肌腱分化相关标志物Col1A1和Col3A1的表达上升。衰老TSPCs在Compound C作用下,p-AMPK的蛋白表达下降、pmTOR和p-S6K1的蛋白表达上升,衰老TSPCs的AMPK-mTOR信号通路活性下降;衰老TSPCs的衰老标志物(P16INK4a、P53和SA-β-gal阳性细胞)表达上升;衰老TSPCs的体外增殖速度下降;衰老TSPCs形成的克隆样细胞团的数量减少,定量结果表明衰老TSPCs的克隆形成效率也降低;衰老TSPCs的体外迁移速度下降;衰老TSPCs的成肌腱分化相关标志物Col1A1和Col3A1的表达下降。结论:本研究揭示了AMPK-mTOR信号通路活性变化在肌腱干细胞的衰老过程中发挥着重要的作用,为防治老化相关肌腱疾病提供了一个新的潜在靶点。第四部分:二甲双胍通过AMPK-mTOR信号通路调控肌腱干细胞衰老来延缓肌腱老化目的:探索二甲双胍是否可以通过AMPK-mTOR信号通路调控肌腱干细胞衰老来发挥延缓肌腱老化的作用。方法:本实验在体内给予SD大鼠含有二甲双胍药物的饲料(0.1%W/W)饲养六个月后,通过影像学、H&E染色、免疫组化和WB实验来评估二甲双胍对跟腱组织内异位骨化程度、组织学评分、衰老标志物表达和AMPK-mTOR信号通路活性的影响。在体外采用q RT-PCR、WB和SA-β-半乳糖苷酶染色实验评估二甲双胍对TSPCs衰老状态的影响。采用WB实验检测二甲双胍对TSPCs的AMPKmTOR信号通路活性的影响。通过构建慢病毒载体特异性地敲低AMPK分子来进一步验证二甲双胍对TSPCs衰老状态的影响是否通过AMPK-mTOR信号通路来介导。进一步,通过Alamar blue、克隆形成能力、体外迁移和q RT-PCR、细胞免疫荧光实验评估二甲双胍对TSPCs的增殖能力、克隆形成能力、迁移能力和细胞外基质合成和分解代谢平衡的影响以及是否由AMPK-mTOR信号通路来介导。结果:研究表明,与对照组相比,体内给予含二甲双胍饲料饲养的大鼠跟腱组织内异位骨化的体积较小、组织学评分更高和衰老标志物P16INK4a和P53的表达更低。同时,二甲双胍干预组跟腱组织内p-AMPK的蛋白表达上升、p-mTOR和pS6K1的蛋白表达下降,AMPK-mTOR信号通路活性更高。体外二甲双胍干预下,TSPCs的衰老标志物(P16INK4a、P53和SA-β-gal阳性细胞)表达下降;TSPCs的体外增殖速度上升;TSPCs形成的克隆样细胞团的数量增加,定量结果表明TSPCs的克隆形成效率也增高;TSPCs的体外迁移速度上升;TSPCs的细胞外基质合成基因Col1A1、Col3A1和Decorin的表达上升,而分解基因MMP-1的表达下降。与二甲双胍干预组TSPCs相比,AMPK被特异性地敲低联合二甲双胍干预组TSPCs的衰老标志物(P16INK4a、P53和SA-β-gal阳性细胞)表达上升;TSPCs的体外增殖速度下降;TSPCs形成的克隆样细胞团的数量下降,定量结果表明TSPCs的克隆形成效率也下降;TSPCs的体外迁移速度下降;TSPCs的细胞外基质的合成基因Col1A1、Col3A1和Decorin的表达下降,而分解基因MMP-1的表达上升,二甲双胍对TSPCs的延缓衰老和功能恢复的保护作用在AMPK被特异性地敲低下会被部分消除。结论:本研究揭示了二甲双胍在体内可以延缓肌腱老化。同时,二甲双胍可通过AMPK-mTOR信号通路来调控肌腱干细胞的衰老,从而发挥延缓肌腱老化的作用,为二甲双胍在肌腱组织中的抗衰老作用提供了新的见解和机制探索,并为防治年龄相关性肌腱疾病提供了一种潜在安全和有效的方法。