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目的:探究溶瘤呼肠孤病毒（reovirus）活化体外扩增的NK细胞,促进NK细胞抗肿瘤效应的相关分子机制,为NK细胞联合reovirus进行肿瘤治疗提供理论依据并奠定实验基础。方法:1.分离健康献血者外周血单个核细胞（PBMC）,以灭活的K562细胞作为饲养细胞,在IL-2作用下体外诱导培养14天左右收集细胞并通过流式细胞术检测细胞纯度;2.Reovirus处理NK细胞（Reo-NK）,以ds RNA类似物Poly（I:C）作对照处理NK细胞（Poly-NK）,流式细胞术检测NK细胞表面活化标志物CD69的表达情况,CCK-8法检测结直肠癌细胞株DLD-1细胞死亡率;ELISA检查穿孔素（perforin）及干扰素-γ（IFN-γ）的分泌水平;3.TLR3/ds RNA复合物阻断剂及TBK1/IKK?抑制剂BX795处理Reo-NK和Poly-NK后,流式细胞术检测NK细胞活化标志物CD69的表达,CCK-8法检测DLD-1细胞死亡率,ELISA检测Reo-NK和Poly-NK的perforin、IFN-γ、TNF-α的分泌水平。结果:1.体外扩增的NK细胞纯度可达90%左右,存活率在95%以上;2.TLR3/ds RNA复合物抑制剂抑制reovirus对NK细胞的活化,降低CD69+NK细胞的阳性率,抑制NK细胞杀伤DLD-1细胞,降低IFN-γ及TNF-α的分泌。（1）DLD-1细胞的死亡率降低:Reo-NK经10mM的TLR3/ds RNA复合物抑制剂处理后(Reo-NKinhibit.),DLD-1细胞死亡率相对未经处理的Reo-NK下降[（49.58±2.1）%vs（65.58±1.3）%],**P<0.01;Poly-NK经10mM的TLR3/ds RNA复合物抑制剂处理后(Poly-NKinhibit.),DLD-1细胞死亡率相对未经处理的Poly-NK下降[（42.4±2.6）%vs（69.28±2.5）%],***P<0.001;（2）TLR3/ds RNA复合物抑制剂抑制降低NK细胞CD69的阳性率;（3）TNF-α及IFN-γ分泌水平下降:经10mM的TLR3/ds RNA复合物抑制剂处理的Reo-NK(Reo-NKinhibit.)相比未经处理的Reo-NK,TNF-α分泌水平降低[（201.3±3.2）vs（268.3±2.1）pg/m L pg/m L],*P<0.05,处理的Poly-NK(Poly-NKinhibit.)相比未经处理的Poly-NK,TNF-α分泌水平降低[（189.3±2.2）vs（231.2±2.1）pg/m L],*P<0.05;同样,IFN-γ的分泌在TLR3/ds RNA复合物抑制剂的作用下也相对未经抑制剂处理时降低。3.TBK1/IKK?激酶复合体抑制剂BX795降低ds RNA对NK细胞的活化,降低CD69+NK细胞的阳性率,抑制NK细胞杀伤DLD-1细胞,降低IFN-γ及perforin的分泌。（1）NK细胞表面活化标记物CD69的表达:Reo-NK与NK相比增加（63.1%vs 58.3%）,Reo-NK+Bx与Reo-NK相比降低:（46.1%vs63.1%）;Poly-NK与NK相比增加（70.5%vs 58.3%）,而Poly-NK+Bx与Poly-NK相比降低:（60.0%vs 70.5%）;（2）NK对DLD-1细胞的杀伤率:Reo-NK与NK相比显著提高[（69.6±1.3）%vs（46.0±2.2）%,(**P<0.01)],10mM的BX795阻断剂处理后（Reo-NK+Bx）对DLD-1细胞杀伤率受抑制[（69.6±1.3）%vs（60.2±2.1）%],（*P<0.05）;Poly-NK与NK相比,对DLD-1细胞的杀伤率有显著上升[（69.3±2.5）%vs（46.0±2.2）%],***P<0.001,10mM的BX795阻断剂处理后（Poly-NK+Bx）相比Poly-NK对DLD-1细胞杀伤率降低至（60.0±1.6）%;（3）NK细胞培养上清中perforin、IFN-γ、TNF-α的分泌水平:a.在perforin的检测中,Reo-NK与单独NK相比分泌水平显著上升[（1120.0±10.96）pg/m L vs（825.0±10.9）pg/m L],*P<0.05,10mM的BX795处理后（Reo-NK+Bx）分泌水平显著低于Reo-NK,[（838.1±8.3）pg/m L vs（1120.1±11.0）pg/m L],*P<0.05;poly-NK与单独NK相比分泌水平显著上升[（1008.5±5.3）pg/m L vs（825.0±10.9）pg/m L],*P<0.05,10mM的BX795处理后（Poly-NK+Bx）分泌水平显著低于Poly-NK[（740±10.58）pg/m L vs（1008.47±5.31）pg/m L];b.在IFN-γ检测中,Reo-NK与单独NK相比,分泌水平显著上升[（127.0±3.6）pg/m L vs（32.6±1.3）pg/m L],**P<0.01;Poly-NK与NK相比也显著上升[（147.0±2.7）pg/m L vs（32.6±1.3）pg/m L],**P<0.01;10mM的BX795处理Poly-NK后（Poly-NK+Bx）分泌水平显著低于Poly-NK[（52.2±4.6）pg/m L vs（147.0±2.7）pg/m L],**P<0.01。结论:1.Reovirus可以直接促进NK细胞的活化,且对NK细胞的活化方式与Poly（I:C）类似;2.Reovirus活化NK细胞的分子机制可能与TLR3信号通路有关。