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多数心血管疾病的发生发展过程中都伴随有血管老化的现象,延缓血管老化是防治心血管疾病的重要策略之一。血管内皮细胞衰老是血管老化的始发环节,在血管老化的发生发展中有重要作用。因此,从内皮细胞衰老的分子机制入手,研究血管老化的变化一直是心血管疾病与衰老关系的研究热点,对防治心血管疾病具有重要意义。高血压病是常见的心血管病之一,其发生发展的过程中伴有血管老化、血管重构的不断出现,故高血压病可作为血管老化的疾病模型用于衰老研究。肾素-血管紧张素-醛固酮系统（Renin-angiotensin-aldosterone System,RAAS）的激活与高血压的发生密切相关,其主要成分血管紧张素Ⅱ（Angiotensin Ⅱ,AngⅡ）能诱导血管内皮细胞衰老,增加炎性因子表达,引起血管损伤。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（Peroxisomeproliferator-activated receptor gamma,PPAR γ）通过调节核因子κB（Nuclearfactorkappa-B,NF-κB）表达抑制细胞因子、趋化因子、基质金属蛋白酶和黏附分子等分泌,改善血管的炎症反应,并可能影响高血压病过程中血管老化的发生。因此,从PPAR γ/NF-κB炎症通路入手,研究血管老化过程中AngⅡ诱导的血管内皮细胞衰老的变化,并使用中药干预治疗,对防治高血压疾病具有重要意义。课题组前期研究证实,益气活血方可通过激活PPARγ通路延缓Ang Ⅱ诱导的内皮细胞衰老并延缓自然衰老大鼠的血管老化,益气活血养阴方可延缓D-gal诱导的小鼠血管老化。本研究通过构建AngⅡ诱导HUVECs衰老模型,以PPAR γ/NF-κB炎性通路为切入点,探索益气活血方和益气活血养阴方对AngⅡ诱导的血管内皮细胞衰老的干预作用,从细胞水平阐明益气活血方和益气活血养阴方延缓血管老化的作用机制。研究一益气活血方及益气活血养阴方对Ang Ⅱ诱导的HUVECs衰老的干预研究目的:构建Ang Ⅱ诱导HUVECs衰老模型,观察益气活血方和益气活血养阴方对血管内皮细胞衰老的影响。方法:通过用不同浓度AngⅡ干预HUVECs48h,实验分为空白组、模型组、10-4 mol/L、10-5 mol/L、10-6 mol/L、10-7 mol/L,确定Ang Ⅱ最佳诱导衰老浓度。利用细胞衰老-β-半乳糖苷酶（Senescence-associated-β-Galactosidase,SA-β-gal）荧光染色法比较荧光值高低,细胞周期分析法观察各期细胞比例,Western blot法检测p16蛋白表达情况。确定最佳诱导衰老浓度后,分别用不同浓度的益气活血方和益气活血养阴方提前12h干预细胞,再与AngⅡ同时处理细胞48h,每12h换药,通过SA-β-gal荧光染色法比较荧光值变化,确定益气活血方和益气活血养阴方最适宜的延缓衰老的浓度。采用10-6 mol/LAngⅡ诱导细胞衰老,100mg/L作为益气活血方和益气活血养阴方的干预浓度,分为空白组、模型组、RSC组、仅RSC组（不加造模药）、RSCS组、仅RSCS组（不加造模药）、替米沙坦组、DMSO组8个组。采用SA-β-gal化学染色法和荧光染色法检测细胞衰老程度,细胞周期分析确定各期细胞比例,免疫荧光、Western blot法检测p16、p53蛋白表达情况。结果:（1）与空白组对比,10-6 mol/L AngⅡ组光镜下出现衰老形态变化,SA-β-gal染色荧光值升高（p＜0.001）,细胞周期停滞于G0/G1比例升高,处于S期细胞比例下降,p16蛋白比例上升（p＜0.01）;筛选中药最佳干预浓度时,100mg/L益气活血方组和益气活血养阴方组均能降低SA-β-gal染色荧光值（p＜0.05,p＜0.01）;（2）正式实验中,与空白组相比,模型组细胞SA-β-gal蓝染率、荧光值均升高,细胞处于G0/G1期比例升高,处于S期比例下降（p＜0.001）,p16蛋白荧光表达升高（p＜0.05）,p53蛋白荧光表达升高（p＜0.01）,p16蛋白含量表达升高（p＜0.001）,p53蛋白含量表达升高（p＜0.01）;与模型组相比,RSC组SA-β-gal蓝染率及荧光强度下降,细胞周期中G0/G1期细胞比例下降,S期细胞比例上升（p＜0.001）,RSC组p16、p53荧光值下降（p＜0.01）,p16、p53蛋白含量降低（p＜0.001）;RSCS组SA-β-gal蓝染率及荧光值下降,G0/G1期细胞比例下降,S期细胞比例上升,p53荧光值下降,p16蛋白含量降低（p＜0.001）,p53蛋白含量下降（p＜0.01）。结论:10-6 mol/L的Ang Ⅱ刺激48 h可加速HUVECs衰老进程,100 mg/L的益气活血方和益气活血养阴方能够延缓HUVECs衰老。研究二益气活血方及益气活血养阴方通过PPAR γ/NF-κB炎性通路对Ang Ⅱ诱导的HUVECs衰老的影响目的:观察益气活血方和益气活血养阴方在血管内皮细胞衰老中对PPARγ/NF-κB炎性通路的影响,追踪SASP变化,探讨二方抑制细胞衰老的可能机制。方法:采用10-6 mol/L AngⅡ干预细胞48h诱导衰老,实验分为空白组、模型组、RSC组、仅RSC组、RSCS组、仅RSCS组、Telm组7个组。采用液相蛋白芯片技术、Elisa法测定S ASP因子含量变化,免疫荧光法检测NF-κB p65、PPAR γ、AT1R蛋白荧光表达,Western blot法测定NF-κB p65、p-NF-κB p65、PPARγ、AT1R蛋白含量变化。结果:（1）与空白组相比,模型组TGF-β1、IL-6因子含量升高（p＜0.01）,CCL-2、IL-8含量上升（p＜0.001）;NF-κBp65荧光表达增强（p＜0.05）,PPARy荧光表达下降,AT1R荧光表达升高（p＜0.001）;NF-κB p65、p-NF-κBp65、AT1R蛋白含量升高（p＜0.001）,PPARγ蛋白含量下降（p＜0.05）;（2）与模型组相比,RSC组TGF-β1含量下降（p＜0.05）,IL-6、CCL-2含量下降,MMP-3、IL-8含量升高（p＜0.001）,NF-κB p65荧光减弱（p＜0.01）,PPARγ荧光表达升高,AT1R荧光表达减弱,NF-κB p65、p-NF-κB p65、AT1R蛋白含量表达下降,PPARγ含量上升（p＜0.001）;RSCS组TGF-β1含量下降（p＜0.05）,IL-6、CCL-2含量下降,MMP-3、IL-8含量升高,NF-κB p65、AT1R荧光表达减弱,PPAR γ荧光表达升高（p＜0.001）。结论:100 mg/L益气活血方和益气活血养阴方可通过干预PPAR γ/NF-κB通路,并抑制CCL-2、IL-6、TGF-β1因子的表达,达到延缓血管内皮细胞炎性衰老的作用。实验三益气活血方及益气活血养阴方调控NF-κB炎性通路抑制Ang Ⅱ诱导的HUVECs衰老的作用目的:沉默NF-κB p65基因后,观察益气活血方和益气活血养阴方延缓血管内皮细胞衰老的变化,探讨两方延缓细胞衰老的机制。方法:通过腺病毒感染技术,降低细胞内NF-κB p65基因的表达,采用荧光显微镜拍照以及PCR技术筛选最佳基因沉默时间及MOI值,基因沉默成功后,采用10-6 mol/L Ang Ⅱ干预细胞48 h诱导衰老,100 mg/L益气活血方和益气活血养阴方干预细胞,实验分为空载病毒组、模型组、模型+NF-κB p65沉默组、RSC组、RSC+NF-κBp65沉默组、RSCS组、RSCS+NF-κB p65沉默组、Telm组、Telm+NF-κB p65沉默组9个组。采用Western blot法测定p53蛋白含量变化。结果:（1）不同MOI腺病毒溶液干预HUVECs后,48 h时荧光强度表达明显增强,MOI为100时shRNA2、shRNA3组荧光强度明显强于空载病毒组和shRNA1组;MOI值为100干预后48h,与空载病毒组相比,shRNA2组NF-κB p65mRNA表达下降（p＜0.001）;（2）正式实验中,与空载病毒组相比,模型组NF-κB p65蛋白含量升高（p＜0.001）;与模型组相比,RSC组NF-κBp65蛋白含量下降（p＜0.001）,RSCS组下降（p＜0.01）;与RSC组相比,RSC+NF-κBp65沉默组NF-κBp65蛋白含量下调（p＜0.01）,与RSCS组相比,RSCS+NF-κB p65沉默组NF-κB p65蛋白含量下调（p＜0.05）,与Telm组相比,Telm+NF-κB p65沉默组NF-κB p65蛋白含量下调（p＜0.01）。与空载病毒组相比,模型组p53蛋白含量升高（p＜0.05）;与模型组相比,各组p53蛋白含量均下降,Telm组具有显著性差异（p＜0.01）,其余各组均具有极显著差异（p＜0.001）;与RSC组相比,RSC+NF-κBp65沉默组p53蛋白含量下调（p＜0.001）,与RSCS组相比,RSCS+NF-κB p65沉默组p53蛋白含量下调（p＜0.001）,与Telm组相比,Telm+NF-KB p65沉默组p53蛋白含量下调（p＜0.001）。结论:益气活血方和益气活血养阴方可通过抑制NF-κB信号通路,下调p53蛋白的表达,延缓Ang Ⅱ诱导的HUVECs衰老。综上所述,本研究使用Ang Ⅱ诱导的HUVECs衰老模型,证明益气活血方和益气活血养阴方可通过PPAR γ/NF-κB炎症信号通路发挥延缓内皮细胞衰老的作用,为益气活血方和益气活血养阴方延缓高血压病过程中血管老化的作用机制提供细胞学水平的证据。