N-甲基-D-门冬氨酸受体(NMDAR,NR)的过度激活与脑血管疾病、脑外伤、脑肿瘤及其继发的脑内综合征(如脑心综合征、消化道出血等)、焦虑、抑郁、疼痛、癫痫、痴呆等重大神经、精神疾患密切相关。如果能及时、有效地选择性干预局部受累脑区NR过度激活所介导的神经兴奋毒性,将为上述疾患提供有效的防治手段。但已有的NR干预药物因严重的毒副作用和难以适时使用而不能进入临床,兴奋毒性脑损害防治策略研究急需取得新的突破。安全、有效的保护性疫苗接种和抗体治疗在该领域是一种新的探索。本实验主要针对人NR主亚基NR1a膜蛋白M3-M4环B细胞表位(NE1)的八分枝抗原肽(multiple antigen peptides, MAPsNR1a)的免疫接种途径进行比较研究,并以MAPsNR1a为筛选抗原淘筛人源性噬菌体抗体库,为兴奋毒性脑损害疫苗免疫防治策略的建立提供实验基础。主要实验内容如下:一. MAPsNR1a的设计、合成和小鼠免疫接种途径研究本实验组已得到人NR1a膜蛋白M3-M4环上一个B表位NE1,固相合成法合成MAPsNR1a,并以MAPsNR1a为免疫原对小鼠进行鼻腔、腹腔、皮下等多途径免疫接种并检测MAPsNR1a特异性抗体;对小鼠进行多指标行为学观察、水迷宫、避暗、跳台等实验及鼻粘膜HE染色,评估MAPsNR1a免疫的安全性和有效性。结果提示,皮下和腹腔免疫接种均检测到MAPsNR1a特异性抗体,且对小鼠的行为、学习记忆能力没有影响,此两种途径安全、有效,可以作为MAPsNR1a抗兴奋毒性脑保护疫苗的接种途径;鼻腔免疫接种未检测到相应抗体,但鉴于其应用简便等优点,可通过佐剂交联、改变MAPsNR1a的溶解状态等方法进行进一<WP=5>步研究。二. NE1特异性人源性单链抗体噬菌体的筛选和鉴定NE1单克隆抗体具有抗兴奋毒性保护效应,如果能大量制备NE1单克隆抗体,对患病人群在有发病征兆或发病早期即给予保护性抗体,不失为一种可行、有效的保护措施。但单克隆抗体不仅制备成本昂贵,而且多为鼠源性,其Fc段是引起人体排异反应的主要部分,即使人源化也会介导抗体依赖的补体激活效应。噬菌体抗体库技术用细菌克隆取代B细胞克隆表达抗体,不经细胞融合,甚至不经免疫,制备针对任何抗原的抗体分子,在生物技术领域中,尤其是人源性特异抗体的筛选和制备上独具优势。该技术自90年代初出现以来, 在多种疾病的诊断、治疗及机制研究中显示出巨大的潜能和广阔的应用前景。本实验利用亲和富集筛选的办法,以MAPsNR1a为筛选抗原淘筛人源性噬菌体重链抗体库和轻链抗体库,各获得一个有较高结合活性的阳性克隆。通过基因重组,将重链可变区基因(VH)克隆入轻链噬菌体载体中,获得了MAPsNR1a特异性单链抗体噬菌体克隆。初步鉴定显示其与MAPsNR1a有高度结合活性,为下一步MAPsNR1a特异性抗体的生物学功能研究及制备提供了基础。