【摘 要】
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目的:本研究通过观察缺氧下尿路上皮细胞TJ和AUM结构及其相关蛋白表达的变化来探讨缺氧对尿路上皮细胞屏障功能的影响,进而了解膀胱出口梗阻导致的组织缺氧对尿路上皮产生的病理变化,为膀胱出口梗阻所致下尿路症状的发病机制提供新的方向和理论依据。方法:（1）本实验以培养于低氧环境下（3%O2、5%CO2、92%N2）的尿路上皮细胞（型号:SV-HUC-1）为实验组,设2h、24h、48h、72h四个时间段
【基金项目】
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遵义医科大学附属医院博士科研启动基金（院字[2018]01）；
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目的:本研究通过观察缺氧下尿路上皮细胞TJ和AUM结构及其相关蛋白表达的变化来探讨缺氧对尿路上皮细胞屏障功能的影响,进而了解膀胱出口梗阻导致的组织缺氧对尿路上皮产生的病理变化,为膀胱出口梗阻所致下尿路症状的发病机制提供新的方向和理论依据。方法:（1）本实验以培养于低氧环境下（3%O2、5%CO2、92%N2）的尿路上皮细胞（型号:SV-HUC-1）为实验组,设2h、24h、48h、72h四个时间段,以相同数量的细胞在常氧环境（21%O2、5%CO2、74%N2）中培养2h、24h、48h和72h作为正常对照组;（2）应用CCK-8实验检测SV-HUC-1尿路上皮细胞在缺氧中的生长活性和增殖情况;（3）通过透射电镜观察SV-HUC-1尿路上皮细胞中TJ和AUM的超微结构,从而评估尿路上皮细胞的屏障功能;（4）q PCR检测TJ和AUM相关蛋白（ZO-1、Claudin1、Occludin、Upk1A、Upk1B、Upk2、Upk3A）的基因表达量;（5）应用WB观察ZO-1、Claudin1、Occludin、Upk1A、Upk1B、Upk2、Upk3A的蛋白表达量;（6）使用免疫荧光观察ZO-1、Claudin1和Occludin的蛋白的分布情况。结果:（1）在第3-10代SV-HUC-1细胞培养时,倒置相差显微镜下观察到细胞呈典型的扁平状,轮廓不规则,细胞生长趋势良好;与常氧组相比,缺氧组的细胞数量随时间延长而减少;（2）CCK-8结果显示,常氧组和缺氧组细胞的OD值随时间均呈上升趋势,缺氧2h组的OD值与常氧2h组相比差异无统计学意义（P＞0.05）,缺氧24h、48h、72h组的细胞OD值明显低于常氧24h、48h、72h组,差异具有统计学意义（P＜0.05）;（3）透射电镜观察结果显示,在常氧组和缺氧2h组的细胞膜周围发现正常的TJ结构,与常氧组相比,缺氧24h、48h、72h组的细胞间TJ结构随着缺氧时间的延长出现破坏,缺氧72h紧密连接严重破坏;在常氧组和缺氧组中均未观察到明显的AUM结构;（4）q PCR结果表明,缺氧2h组中ZO-1、Claudin1及Occludin的m RNA表达量与常氧2h组相比,差异无统计学意义（P＞0.05）,缺氧24h、48h、72h组中ZO-1、Claudin1、Occludin的m RNA表达水平与常氧24h、48h、72h组相比明显下降,且随时间延长而不断降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;与常氧组相比,缺氧状态下Upk1A、Upk1B、Upk2和Upk3A的m RNA表达在2h、24h、48h、72h组中均无显著的统计学差异（P＞0.05）;（5）WB结果显示,缺氧2h组中ZO-1、Claudin1及Occludin的蛋白表达量较常氧2h组相比差异无统计学意义（P＞0.05）,缺氧24h、48h、72h后ZO-1、Claudin1、Occludin的蛋白表达量与常氧组相比明显下降,且随时间延长而不断降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）;缺氧各组Upk1A、Upk1B、Upk2和Upk3A的蛋白表达差异较常氧各组相比无统计学意义（P＞0.05）;（6）免疫荧光显示,常氧组细胞的ZO-1、Claudin1及Occludin蛋白正常分布在细胞核外,而缺氧组中ZO-1、Claudin1、Occludin的荧光强度随时间逐渐减弱,细胞质连接被破坏、分布不连续。结论:缺氧可抑制尿路上皮细胞的增殖能力;缺氧可通过破坏尿路上皮细胞的TJ结构并抑制ZO-1、Claudin1、Occludin蛋白的表达来影响尿路上皮细胞的屏障功能;缺氧对Upk蛋白无明显影响。
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