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目的:建立重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）大鼠模型,确认青蒿琥酯（artesunate,AS）治疗SAP大鼠的作用。建立可以模拟SAP病理生理过程中炎症反应的细胞模型,为深入研究SAP病理生理机制、新药研究的细胞模型以及AS治疗大鼠SAP的分子机制奠定基础。方法:一、SAP大鼠模型的建立与AS治疗作用的研究1.SAP大鼠模型的建立:胰胆管逆行注射不同剂量牛磺胆酸钠（40、70、100mg/kg）,观察大鼠7天生存率,筛选建立SAP大鼠模型的最佳剂量;2.饲养时间及术后给粮时间对SAP模型大鼠的死亡率影响:大鼠分别适应性喂养1周、2周,SAP模型建立后分别于6 h、12 h时相点给予饲料,观察各组SAP模型大鼠7天生存率,统计并判断饲养时间及术后给粮时间对SAP大鼠模型是否有影响;3.AS治疗SAP模型大鼠的时相点选择:SAP大鼠模型建立后给予AS的时相点（0、2、12 h,0、4、12 h,0、2、4、12 h等3种不同时相点给药后,每隔10～12h继续给予AS,连续给药7天）,观察各组SAP模型大鼠7天生存率,统计后选择最佳给药时相点;4.AS治疗SAP模型大鼠的剂量选择:SAP大鼠模型建立后给予不同AS剂量（0.5、1.5、4.5 mg/kg）,给药的时相点为模型建立后0、2、12 h,之后每间隔10～12h给药,连续7天给药,观察各组SAP模型大鼠7天生存率,统计后选择AS最佳治疗剂量;5.AS对SAP大鼠模型的治疗评价:SAP大鼠模型建立后给予AS剂量为1.5mg/kg,时相点为模型建立后0、2 h,模型建立后分别于6 h、12 h取材,使用试剂盒检测腹主动脉血中血清淀粉酶活力,使用试剂盒检测胰腺组织中MPO活力及IL-6、TNF-α水平,评价AS的治疗作用。二、模拟SAP炎症反应的细胞模型的建立和AS对该细胞模型作用的研究1.TP浓度的初步考察:将TP浓度设置为1、5、20μg/m L,分别处理小鼠腹腔巨噬细胞（mouse peritoneal macrophages,PMs）,检测细胞上清中的TNF-α水平（ELISA法）,观察各组细胞上清中TNF-α水平情况;2.LPS浓度的初步考察:将LPS浓度设置为1、3、9 ng/m L,分别处理PMs,检测细胞上清中的TNF-α水平（ELISA法）,观察各组细胞上清中TNF-α水平情况;3.TP、LPS浓度的筛选:固定TP浓度的为5μg/m L,协同不同浓度的LPS（1、3、9 ng/m L）处理PMs;固定LPS浓度为1 ng/m L,协同不同浓度的TP（1、5、20μg/m L）处理PMs,检测细胞上清中的TNF-α水平（ELISA法）,根据结果筛选LPS及TP刺处理PMs的最佳浓度;4.评价LPS与TP的协同作用在RAW264.7细胞上的重现性:固定TP浓度的为5μg/m L,协同不同浓度的LPS（1、3、9 ng/m L）处理RAW264.7细胞;固定LPS浓度为3 ng/m L,协同不同浓度的TP（1、5、25μg/m L）处理RAW264.7细胞,检测细胞上清中的TNF-α水平（ELISA法）,根据RAW264.7细胞的实验结果与PMs相比较,确定LPS和TP的协同作用是否在PMs和RAW264.7细胞上具有差异;5.模拟SAP细胞模型的建立:LPS 1 ng/m L联合5μg/m L TP处理PMs,检测细胞上清中TNF-α、IL-6水平（ELISA法）,进一步确定LPS和TP浓度的选择;6.SAP细胞模型中各基因表达高峰时相点的选择:LPS 1 ng/m L+TP 5μg/m L处理PMs,于0、2、4、8、12 h时相点收取细胞上清及细胞沉淀,上清检测TNF-α水平（ELISA法）,细胞沉淀使用实时定量聚合酶链反应检测不同时相点细胞中Myd88、Traf6、Rel A（编码NFκB p65）、Beclin1 m RNA的表达情况（RT-q PCR法）,根据结果选择需要检测的基因最佳收样时相点;7.SAP细胞模型中各基因表达情况:LPS 1 ng/m L联合TP 5μg/m L处理PMs,于8 h收取细胞沉淀,使用实时定量聚合酶链反应检测Myd88、Traf6、P62 m RNA的表达情况（RT-q PCR法）,根据结果观察SAP细胞模型中上述基因的表达,初步探讨LPS与TP产生协同效应的作用机制;8.SAP细胞模型中细胞膜表面TLR4蛋白的表达情况:LPS 1 ng/m L联合TP 5μg/m L处理PMs,于2 h后收样,使用流式细胞术检测细胞模型中各组细胞膜表面的TLR4蛋白的表达情况,初步探讨LPS与TP产生协同效应的作用机制;9.自噬抑制剂对SAP细胞模型释放前炎症细胞因子的影响:自噬抑制剂LY294002（10μM）及Wortmannin（1μM）预孵2 h,LPS1 ng/m L联合TP 5μg/m L处理PMs,检测细胞上清中TNF-α、IL-6的水平（ELISA法）,根据细胞实验结果判断药物治疗SAP大鼠模型作用机制的猜想。10.AS对SAP细胞模型释放前炎症细胞因子的影响:AS（20μg/m L）预孵2 h,LPS1 ng/m L联合TP 5μg/m L处理PMs,检测细胞上清中TNF-α、IL-6的水平（ELISA法）,根据细胞实验的结果确定AS对SAP大鼠模型治疗作用;结果:一、SAP大鼠模型的建立与AS治疗作用的研究1.牛磺胆酸钠剂量为100 mg/kg时,大鼠7天生存率为41.7%,与课题组前期建立的结果一致;2.SAP大鼠的死亡率与高原地区大鼠适应性喂养时间长短及术后给予饲料时间无相关性（p＞0.05）;3.SAP大鼠模型建立后,给予AS的时相点为术后0、2、12 h,之后每间隔10～12 h给药,连续7天给药能够提高SAP大鼠7天生存率（p＜0.05）;4.SAP大鼠模型建立后,给予剂量为1.5 mg/kg的AS能够延长SAP模型大鼠生存时间,1.5 mg/kg的AS组第2天生存率90%,高于0.5 mg/kg AS组的70%和4.5 mg/kg AS组的80%;5.SAP大鼠模型建立后6 h,血清中淀粉酶活力、胰腺组织中的MPO活力及炎症因子IL-6显著增高（p＜0.05）;AS能够在SAP模型建立后6 h显著降低胰腺组织中的IL-6水平,但降低TNF-α水平和淀粉酶、MPO活力时效果不佳,有下降趋势,但无统计学意义。二、模拟SAP炎症反应的细胞模型的建立和AS对该细胞模型作用的研究1.1μg/m L的TP并不能显著诱导TNF-α的释放（p＞0.05）;但是,随着TP浓度的增加,5μg/m L的TP即能显著诱导TNF-α的释放（p＜0.01）,20μg/m L的TP则能更显著诱导TNF-α的释放（p＜0.01）;2.不同浓度的LPS均能诱导TNF-α的释放,随着LPS浓度的增加,各组TNF-α释放水平逐渐增加,其中3、9 ng/m L的LPS均能显著诱导TNF-α的释放（p＜0.01）,LPS诱导TNF-α的释放的能力呈现良好的量效关系（p＜0.01）;3.LPS浓度为1 ng/m L,TP浓度为1、5μg/m L时,并不能诱导PMs及RAW264.7细胞释放大量的TNF-α;4.LPS和TP均处于低浓度状态时,对诱导PMs和RAW264.7细胞释放前炎症细胞因子释放具有一定的协同作用,初步筛选LPS浓度为1 ng/m L、TP浓度为5μg/m L用于建立PMs的炎症细胞模型;5.TP浓度为5μg/m L联合LPS 1 ng/m L能够协同诱导PMs释放前炎症细胞因子TNF-α、IL-6的释放;6.LPS 1 ng/m L协同TP浓度为5μg/m L刺激PMs时,Rel A（编码NFκB p65）在2 h时表达最高,而Myd88、Beclin1、Traf6 m RNA在8 h时表达最高（p＜0.05）;7.LPS协同TP能够增强PMs中Myd88、Traf6、P62 m RNA的表达（p＜0.05）;8.TP和LPS具有协同增加PMs膜上的TLR4蛋白的表达,其高于单独的LPS组和TP组（p＜0.05）;9.自噬抑制剂LY294002、Wortmannin能够抑制由LPS协同TP诱导PMs释放的前炎症细胞因子IL-6、TNF-α（p＜0.05）。10.AS能够抑制由LPS协同TP诱导的PMs释放的前炎症细胞因子IL-6、TNF-α（p＜0.01）;结论:1.AS对SAP模型大鼠的治疗作用与其体内抑制前炎症细胞因子IL-6水平密切相关。2.低浓度的LPS和TP诱导巨噬细胞释放前炎症细胞因子的释放具有协同作用,其作用机制与TLR4/NFκB信号转导通路和自噬信号通路密切相关。3.AS能抑制LPS协同TP诱导的巨噬细胞释放前炎症细胞因子,从而发挥抗炎的作用。