【摘 要】
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目的:观察结核分枝杆菌Rv3737对分枝杆菌感染巨噬细胞凋亡的影响,探讨Rv3737对巨噬细胞凋亡的分子机制。方法:以耻垢分枝杆菌及结核分枝杆菌为实验菌株,分别构建过表达Rv3737的耻垢分枝杆菌（MS::p MV261＿Rv3737）及敲除Rv3737的结核分枝杆菌（H37Rv△Rv3737）和各自的空载菌株MS::p MV261、H37Rv-WT,通过Western Blot及Real-tim
【基金项目】
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国家自然科学基金（项目批准号:81760003,81960004）； 贵州省科学技术基金（课题编号:黔科合基础-ZK[2021]一般348）；
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目的:观察结核分枝杆菌Rv3737对分枝杆菌感染巨噬细胞凋亡的影响,探讨Rv3737对巨噬细胞凋亡的分子机制。方法:以耻垢分枝杆菌及结核分枝杆菌为实验菌株,分别构建过表达Rv3737的耻垢分枝杆菌（MS::p MV261＿Rv3737）及敲除Rv3737的结核分枝杆菌（H37Rv△Rv3737）和各自的空载菌株MS::p MV261、H37Rv-WT,通过Western Blot及Real-time PCR（q PCR）分别验证过表达菌株及敲除菌株。把敲除菌株及过表达菌株在体外培养,观察Rv3737基因对分枝杆菌生长的影响;将MS::p MV261＿Rv3737、MS::p MV261及H37Rv△Rv3737及H37Rv-WT感染巨噬细胞,通过菌落形成单位（CFU）计算分枝杆菌在巨噬细胞中的存活情况;以MOI=10感染巨噬细胞,流式细胞术检测Annexin-V/PI的表达,评估Rv3737对感染巨噬细胞凋亡的影响,并利用Western Blot技术检测感染巨噬细胞凋亡标志蛋白Caspase 3、死亡受体通路中凋亡代表蛋白Caspase 8、线粒体通路中凋亡代表蛋白Caspase 9和内质网应激中凋亡代表蛋白Caspase 12的表达,分析Rv3737调控巨噬细胞凋亡的具体机制。结果:通过体外生长曲线结果显示过表达及敲除Rv3737不影响分枝杆菌的体外生长。MS::p MV261＿Rv3737感染巨噬细胞后的胞内生存率显著高于对照组MS::pMV261;H37Rv△Rv3737感染巨噬细胞后的胞内生存率明显低于对照组H37Rv-WT,表明Rv3737基因有利于分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。通过流式细胞术检测发现过表达Rv3737后Annexin-V（+）/PI（+）明显降低,且Western Blot结果显示Caspase 3的剪切明显下降,表明Rv3737明显抑制了分枝杆菌感染巨噬细胞的凋亡。Western Blot检测结果显示外源性凋亡指标即死亡受体介导的凋亡中关键靶分子Caspase 8的剪切明显抑制,但内源性线粒体通路及内质网应激通路中的关键靶分子Caspase 9及Caspase 12的剪切无明显异常,同时进一步检测发现介导死亡受体凋亡通路的上游靶分子FADD和FAS在过表达Rv3737组明显低于对照组,相反,敲除结核分枝杆菌Rv3737后FADD及FAS的表达明显升高,表明跨膜蛋白Rv3737抑制死亡受体通路介导的外源性凋亡。结论:Rv3737通过死亡受体介导的外源性凋亡通路抑制分枝杆菌感染巨噬细胞的凋亡,从而有助于躲避宿主细胞固有的免疫攻击,促进分枝杆菌在宿主细胞内的存活和进一步感染。
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