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由于水体中的溶解氧(Dissolved oxygen,DO)具有容量少、易变化和扩散性弱等特点,因此鱼类的行为和生理变化极易受到水中DO变化的影响。低氧胁迫会造成细胞内线粒体氧化磷酸化过程得不到充足的O2而反应不充分,导致自由电子的增加,从而生成活性氧(Reactive oxygen species,ROS),ROS的大量累积会引起细胞内大分子的氧化损伤和线粒体肿胀以及线粒体膜电位的去极化。转录因子Fox O(Forkhead box O)基因家族属于一个Fox蛋白亚家族,通过调控下游的靶基因来执行各种生物功能。有研究表明,一些自噬相关基因的表达会受到Fox O基因家族的调控,然而鱼类Fox O基因家族是否在低氧胁迫下介导自噬以及可能存在的调控机制目前尚不清楚。因此,本研究以团头鲂(Megalobrama amblycephala)为研究对象,克隆了团头鲂foxO家族的7个基因,并对其进行生物信息学分析;利用q PCR技术对这些基因的时空表达及低氧胁迫后的表达变化进行了分析;同时在细胞水平研究了foxO1在低氧介导自噬中的作用。主要研究结果如下:1.团头鲂foxO基因家族的克隆及序列分析通过PCR扩增及组学测序获得7个团头鲂foxO家族基因,foxO1a/b、foxO3a/b、foxO4、foxO6a/b的CDS序列,分别为1965 bp、1892 bp、1929 bp、1959 bp、1878 bp、1803 bp和2157 bp,编码654、630、642、652、625、600和710个氨基酸。SMART结构域分析显示这些基因属于典型的Fox O家族蛋白,具有保守的Forkhead(FH)、FOXO_KIX_bdg和FOXO-TAD结构域。系统进化树分析显示,团头鲂Fox O与其它鲤科鱼类同源基因具有较高的相似性。2.团头鲂foxO基因的时空表达及其低氧条件下的表达变化利用qPCR检测了foxO基因家族在团头鲂肝、脑、肠、鳃、心、肌肉、血液、脾和肾9个组织中的表达模式。foxO基因家族在所检测的各组织中均有表达,但组织间表达的差异较大。其中,团头鲂foxO4主要表达在血液中,foxO6a主要表达在肝脏中,而foxO6b主要在脑组织中表达。在不同发育时期的表达分析显示,foxO1a/b和foxO6a/b在胚胎发育早期的表达模式类似,均在眼色素沉淀晚期(72.2 hpf,hours post fertilization)、体节生成期(94.4 hpf)和受精后10 d(10 dpf,days post fertilization)时表达量较高。foxO3a在大部分时期表达量都很低,而foxO3b在不同时期的表达变化较大。foxO4在体节出现期(15.4 hpf)、眼色素沉淀晚期、体节生成期和受精后10 d表达量较高。经急性低氧处理后,团头鲂foxO家族基因的表达水平在所检测的组织中大部分呈现显著上调趋势,尤其是在肌肉组织中,说明foxO基因可能在团头鲂应对低氧胁迫中发挥重要作用。3.低氧会影响细胞活力,导致线粒体损伤利用CoCl2模拟低氧环境处理草鱼肝脏细胞,分析低氧对细胞活力的影响,结果发现除100μmol/L Co Cl2处理组外,其它各处理组与对照组相比,细胞活力均呈现显著下降趋势。进一步分析显示随着Co Cl2处理时间的延长,细胞活力不断下降。线粒体膜电位及ROS的检测结果发现,随着Co Cl2浓度的增加和处理时间的延长,线粒体膜电位都会逐渐降低,而细胞中ROS的含量逐渐增加,说明低氧会导致细胞中线粒体损伤。4.foxO1a/foxO1b在低氧介导线粒体自噬中的作用CoCl2模拟低氧处理草鱼肝脏细胞后,利用Western blot和q PCR分析自噬相关基因的表达,结果显示,自噬相关基因LC3-II蛋白,以及beclin-1、pink1和p62 m RNA的表达水平都随着Co Cl2浓度及处理时间的逐渐增加而增加,同时,foxO1a和foxO1b m RNA的表达水平也逐渐升高,说明低氧会导致线粒体自噬的发生。基于si RNA干扰分析显示抑制foxO1b的表达会引起自噬相关基因的m RNA水平降低,推测foxO1b可能参与低氧介导的线粒体自噬过程。5.PI3K信号通路参与foxO1a/1b的转录调控为了进一步分析PI3K信号通路是否参与foxO1a/1b的转录调控,本研究利用PI3K信号通路抑制剂LY294002处理细胞,发现抑制剂可以降低AKT的磷酸化水平,LC3-II蛋白的表达量升高,同时其它自噬基因beclin1、pink1和p62的m RNA表达量也逐渐升高。另外,我们也发现抑制剂处理后,foxO1a和foxO1b两个基因的表达均有不同程度的上调,但foxO1b的上调相对于foxO1a更为明显。这些结果推测PI3K/AKT通路可能参与了低氧介导的foxO1a/1b的转录调控。