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心肌缺血-再灌注损伤是指在心肌缺血发生后一定时间内恢复血供,可导致缺血心肌组织发生更严重的损伤,这一损伤在一定程度上降低了治疗的效果。当前,如何保护心脏减轻或消除缺血-再灌注损伤已成为国内外学者的研究热点。2003年,Zhao等首次提出缺血后适应(ischemic post-conditioning)的概念:即心肌缺血后、在长时间的再灌注之前先进行数次、短暂的冠脉再灌注-再缺血循环,可以减小再灌注引起的损伤,产生保护作用。
缺血后适应对于心肌起保护作用的机制尚未完全阐明。现趋向于认为其机制主要是:通过释放多种内源性触发介质,经多时相的信号转导激活效应物,进而发挥心肌保护作用。促生存激酶磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3-OHkinase,PI3K)和细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extra-cellular signal-regulated proteinkinase1/2,ERK1/2)被认为是缺血后适应发挥心脏保护作用的重要靶点。
目前,通过使用可以模拟内源性机制的药物来发挥后适应保护作用的“药物后适应(pharmacologic post-conditioning)”研究日渐成为临床应用研究的一个方向,即在再灌注瞬时或再灌注前不久给予药物,以观察其对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用。因其在心肌缺血发生后、再灌注开始前实施,具有“可操作性大”这一明显优势,进而可以为临床提供更易掌控的心脏保护方案。
本研究选用内脂素(visfatin)作为保护药物,旨在探讨其对心肌缺血-再灌注损伤的保护作用及其作用机制。
方法:
一、建立大鼠在体心肌缺血-再灌注模型将38只健康雄性SD大鼠随机分为SH组(假手术)、I/R组(缺血-再灌注)、L组(LY294002处理)、V组(visfatin处理)及L+V组(LY294002+visfatin处理)等五组。除SH组外,其余各组均行冠状动脉左前降支(LAD)结扎缺血30 min,再灌注120 min的处理。其中,I/R组在再灌注瞬时予以注射生理盐水处理;L组在再灌注瞬时予以注射LY294002处理;V组在再灌注瞬时予以注射visfatin处理;L+V组在再灌注瞬时予以注射LY294002+visfatin处理。以结扎LAD后心电图出现ST段弓背抬高,T波高耸等改变表示缺血成功;放松结扎线后,抬高的ST段下降50%以上为再灌注成功。再灌注结束后,经腹主动脉取血,离心后留取血清备检;迅速分离左心室,N.S冲洗干净,分两份:一份-80℃冰冻保存,一份中性甲醛固定24小时后制备蜡块。
二、指标测定
1、血清指标检测应用全自动化学发光免疫分析仪检测血清标本中MYO、cTnI及hs-TnT等心肌损伤标志物的水平,评价心肌损伤程度。
2、细胞凋亡检测蜡块标本切片后,应用TUNEL染色法进行细胞凋亡检测,光学显微镜下计数凋亡心肌细胞数和心肌细胞总数,以凋亡心肌细胞数/心肌细胞总数×100%作为凋亡指数(AI),评价心肌细胞的凋亡程度。
3、心肌组织p-Akt表达的检测冰冻标本提取蛋白后,行Western-blot检测p-Akt的表达,分别以各组p-Akt密度值与β-actin密度值的比值作为相对表达量,进行统计分析。
三、统计学处理采用SPSS19.0统计软件进行数据分析,计量资料以(x)±s表示,两两比较采用t检验。
结果:
1、血清指标检测结果(1) I/R组与SH组比较,血清中MYO、cTnI、hs-TnT水平均明显增高,t值分别为13.65、20.64、22.81,p<0.01,说明缺血-再灌注对于心肌组织有明显损伤作用;(2)L组与I/R组比较,血清中MYO、cTnI、hs-TnT水平均无明显变化,t值分别为-1.026、-1.769、-1.834,p>0.05,说明单独应用LY294002并不具有心肌保护作用;(3)V组与I/R组比较,血清中MYO、cTnI、hs-TnT水平均明显降低,t值分别为-9.103、-12.235、-19.079,p<0.01,说明与单纯缺血-再灌注相比,在再灌注瞬时应用visfatin可减小再灌注对于心肌组织的损伤,具有保护作用;(4)L+V组与I/R组比较,血清中MYO、cTnI、hs-TnT水平均无明显变化,t值分别为-2.072、-1.401、-1.320,p>0.05,说明LY294002可以消除visfatin对于再灌注心肌的保护作用。
2、细胞凋亡检测结果(1) I/R组与SH组比较,心肌细胞凋亡指数明显增高,t值为8.715,p<0.01,说明缺血-再灌注可以导致心肌细胞凋亡增加,对于心肌组织有明显损伤作用;(2)L组与I/R组比较,心肌细胞凋亡指数无明显变化,t值为-0.920,p>0.05,说明单独应用LY294002并不能减少心肌细胞的凋亡;(3)V组与I/R组比较,心肌细胞凋亡指数明显降低,t值为-5.002,p<0.01,说明与单纯缺血-再灌注比较,在再灌注瞬时应用visfatin可减少心肌细胞的凋亡,具有心肌保护作用;(4)L+V组与I/R组比较,心肌细胞凋亡指数无明显变化,t值为-1.743,p>0.05,说明LY294002可以消除visfatin对于再灌注心肌的保护作用。
3、心肌组织p-Akt表达的检测结果(1)I/R组与SH组比较,心肌组织中p-Akt的相对表达水平无明显变化,t值为-0.129,p>0.05;L组与I/R组比较,心肌组织中p-Akt的相对表达水平亦无明显变化,t值为0.574,p>0.05,说明单纯的缺血-再灌注对于p-Akt的相对表达水平并无影响;(2)V组与I/R组比较,心肌组织中p-Akt的相对表达水平明显增加,t值为19.933,p<0.01,说明与单纯缺血-再灌注相比,在再灌注瞬时应用visfatin可明显提高p-Akt的相对表达水平;(3)L+V组与I/R组比较,心肌组织中p-Akt的相对表达水平无明显变化,t值为0.814,p>0.05,即LY294002可以抑制visfatin作用下p-Akt的相对表达水平的增高,由此说明visfatin对于缺血-再灌注心肌的保护作用是通过PI3K/Akt途径实现的。
结论:
1、visfatin可以降低心肌损伤标志物的水平、减少心肌细胞的凋亡,对于大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤具有保护作用;
2、visfatin对于大鼠在体心肌缺血-再灌注损伤的保护作用是通过PI3K/Akt途径实现的。