【摘 要】
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山茱萸（Cornus officinalis）是多年生落叶乔木或灌木,其果实一般在九月份以后颜色加深由绿转红,趋于成熟,成熟果实去核干燥后入药,即中药山茱萸。山茱萸含有环烯醚萜苷类、多糖、三萜酸类等多种物质,可以治疗肝肾虚弱、糖尿病、阿尔兹海默症等病症。以莫诺苷和马钱苷为主的环烯醚萜苷类物质是山茱萸的特征活性成分,甲羟戊酸（MVA）途径参与该类物质的合成,3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A合酶（HM
【基金项目】
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国家自然科学基金（U1404829）； 中央本级重大增减支项目“名贵中药资源可持续利用能力建设项目”（2060302）； 河南省自然科学基金（202300410151）；
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山茱萸（Cornus officinalis）是多年生落叶乔木或灌木,其果实一般在九月份以后颜色加深由绿转红,趋于成熟,成熟果实去核干燥后入药,即中药山茱萸。山茱萸含有环烯醚萜苷类、多糖、三萜酸类等多种物质,可以治疗肝肾虚弱、糖尿病、阿尔兹海默症等病症。以莫诺苷和马钱苷为主的环烯醚萜苷类物质是山茱萸的特征活性成分,甲羟戊酸（MVA）途径参与该类物质的合成,3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A合酶（HMGS）、3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）是MVA途径中的两个关键酶,研究这两个基因的功能为解析山茱萸萜类次生代谢产物合成途径的分子机制奠定基础。本研究在前期获得的转录组数据基础上,扩增得到Co HMGS、Co HMGR基因,并进行了生物信息学分析;观察Co HMGS、Co HMGR蛋白的亚细胞定位;分析外源激素茉莉酸甲酯（Me JA）、乙烯利（ETH）对Co HMGS、Co HMGR基因表达水平的影响,测定不同处理对山茱萸莫诺苷和马钱苷含量的影响;在拟南芥中过表达Co HMGS、Co HMGR基因,筛选鉴定转基因植株。主要结果如下:（1）克隆得到山茱萸Co HMGS、Co HMGR基因,Co HMGS基因完整开放阅读框长1413 bp,编码470个氨基酸,蛋白质分子式为C2304H3555N605O705S27,相对分子量51875.8 Da,理论等电点6.13,蛋白整体带负电荷,亲水性均值为-0.261,是不稳定亲水性蛋白,预测其亚细胞定位于细胞质内,不含跨膜结构。Co HMGR基因的开放阅读框长1731 bp,编码576个氨基酸,蛋白质分子式为C2677H4320N734O822S32,相对分子量60966.09 Da,理论等电点6.12,蛋白整体带负电荷,亲水性均值为0.143,是稳定疏水性蛋白,预测其亚细胞定位于内质网。（2）通过酶切重组法构建表达载体p CAMBIA1300-Co HMGS-GFP、p CAMBIA1300-Co HMGR-GFP,分别转入农杆菌GV3101中,将制备好的菌液从下表皮注射到烟草叶片中,激光共聚焦显微镜下观察Co HMGS、Co HMGR蛋白质分别定位于细胞质和内质网中。（3）不同浓度的Me JA、ETH分别处理山茱萸两年生幼苗,实时荧光定量PCR（q PCR）结果表明100μmol/L Me JA处理1 d和750 mg/L ETH处理3 d对Co HMGS基因的表达影响最大,表达量分别是对照组的1.77倍、3.57倍;200μmol/L Me JA、250 mg/L ETH处理1 d后Co HMGR的表达量最高,分别为对照组的9.92倍、10.63倍,这两个处理在3 d、5 d、7 d内Co HMGR表达量逐渐下降,但始终显著高于对照组。（4）高效液相色谱法（HPLC）测定200μmol/L Me JA,250 mg/L、750 mg/L ETH处理下的样品。莫诺苷含量处理1 d后达到最大值;200μmol/L Me JA、250mg/L ETH处理后的第7 d马钱苷含量最高,750 mg/L ETH处理第5 d马钱苷含量达到最大值。q PCR和HPLC测定结果说明一定浓度的Me JA和ETH处理可以增强Co HMGS、Co HMGR基因的表达水平,也是萜类活性成分莫诺苷、马钱苷含量的强力诱导子。（5）通过花序浸染法在拟南芥中过表达Co HMGS、Co HMGR基因,提取拟南芥DNA筛选转基因植株,q PCR检测目的基因表达,为后续研究Co HMGS、Co HMGR基因的功能提供试验材料。
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