【摘 要】
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芍药（Paeonia lactiflora Pall.）为芍药科芍药属花卉,是我国传统名花,其花梗长而挺直,花色丰富,花型娇美,非常适合做切花应用。‘桃花飞雪’是典型的乙烯跃变型花卉,花朵的开放和衰老与乙烯密切相关。因此,研究乙烯信号转导关键基因PlEIN3/EIL1调控芍药切花衰老的分子机制具有重大意义。本研究以开花指数Ⅱ级绽口期‘桃花飞雪’花枝为试验材料,使用去离子水（CK）、乙烯利（CEPA
【基金项目】
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国家自然科学基金（U1204323）；
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芍药（Paeonia lactiflora Pall.）为芍药科芍药属花卉,是我国传统名花,其花梗长而挺直,花色丰富,花型娇美,非常适合做切花应用。‘桃花飞雪’是典型的乙烯跃变型花卉,花朵的开放和衰老与乙烯密切相关。因此,研究乙烯信号转导关键基因PlEIN3/EIL1调控芍药切花衰老的分子机制具有重大意义。本研究以开花指数Ⅱ级绽口期‘桃花飞雪’花枝为试验材料,使用去离子水（CK）、乙烯利（CEPA）、硫代硫酸银（STS）、乙烯利+硫代硫酸银（CEPA+STS）瓶插切花,分析切花开放衰老情况;应用q RT-PCR技术,分析PlEIN3/EIL1和PlEBF1/EBF2基因在四种不同处理下的表达模式;构建p CAMBIA1300-PlEIN3/PlEIL1/PlEBF1/PlEBF2-GFP融合表达载体,使用激光共聚焦显微镜扫描烟草叶片下表皮细胞,鉴定PlEIN3/EIL1和PlEBF1/EBF2蛋白的功能定位;构建酵母双杂交重组表达载体p GADT7-PlEIN3/EIL1和p GBKT7-PlEBF1/EBF2,并利用酵母双杂交系统鉴定PlEIN3/EIL1与PlEBF1/EBF2蛋白间相互作用;使用含有p CAMBIA1300-Ca MV35S-PlEIN3/EIL1重组质粒的农杆菌菌液侵染拟南芥,筛选带有抗性基因的阳性植株。主要试验结果如下:（1）切花形态变化及生理指标测定结果显示,CEPA处理加速切花衰老,STS处理延缓切花衰老,并且二者存在拮抗作用。PlEIN3/EIL1、PlEBF1/EBF2表达模式分析结果显示,在CK处理下PlEIN3/EIL1、PlEBF1/EBF2均于48 h出现表达峰;在CEPA处理下,PlEIN3于12 h出现表达峰,PlEIL1在整个瓶插期间表达水平均低于0 h,PlEBF1/EBF2于6 h出现表达峰;在STS处理下,PlEIN3于144 h出现表达峰,PlEIL1于12 h出现表达峰,PlEBF1/EBF2在整个瓶插期间表达水平均低于0 h;在CEPA+STS处理下,PlEIN3/EIL1于48 h出现表达峰,PlEBF1/EBF2于12 h出现表达峰。（2）成功构建了p CAMBIA1300-PlEIN3/PlEIL1/PlEBF1/PlEBF2-GFP重组融合表达载体,并转化农杆菌GV3101感受态细胞,将含有重组质粒的农杆菌菌液注入烟草叶片,观察前使用DAPI染色液标记细胞核,利用激光共聚焦显微镜扫描烟草的下表皮细胞,发现PlEIN3/EIL1和PlEBF1/EBF2蛋白均定位于细胞核中。（3）成功构建了酵母双杂交重组猎物表达载体p GADT7-PlEIN3/EIL1和重组诱饵表达载体p GBKT7-PlEBF1/EBF2,将猎物表达载体与诱饵表达载体两两配对转化Y2H Gold酵母感受态细胞,发现四种组合均能激活Y2H Gold酵母菌株下游的4个报告基因,初步证明PlEIN3/EIL1与PlEBF1/EBF2蛋白间存在相互作用,表明PlEIN3/EIL1可能受翻译后调控。（4）应用农杆菌介导的花浸法,开展了PlEIN3/EIL1转化拟南芥研究,在含有潮霉素的LB平板上筛选到1株转PlEIN3拟南芥植株和2株转PlEIL1拟南芥植株,并应用特异性PCR引物进行扩增,成功扩增出潮霉素抗性基因和PlEIN3/EIL1目的条带,初步筛选得到了转基因阳性植株,为后续开展PlEIN3/EIL1功能鉴定研究提供了试验材料。
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