研究背景:周围神经损伤是临床上常见的一种创伤,导致肢体运动及感觉功能的受限甚至丧失,严重影响患者的生活质量,带来沉重的社会负担。目前对于周围神经的离断伤,首选治疗方式依旧是直接吻合。尽管随着显微外科技术的发展,神经吻合质量有了大幅度提高,但其结果仍然难以令人满意。离断神经吻合后疗效不佳的主要原因与神经再生速度缓慢与周围组织的粘连形成有关。因此,已经有一些研究报道了几种自体材料和人工生物材料应用于神经吻合口周围,形成物理阻隔,起到了防粘连和促进神经的再生的作用。尽管这些神经包裹材料在一定程度上解决了吻合口周围粘连的问题,加快神经再生的速度,但是仍存在一些缺点和局限性,如自体材料供体部位的局限性,人工生物材料复杂的制备过程、生物相容性较差、降解周期过长不利于周围神经的再生等问题。因此,迫切需要设计一种制备方法简单、能有效促进神经再生、防止神经吻合术后粘连的新型材料。聚丙交酯-乙交酯（PLGA）是一种生物相容性、降解性,机械强度适宜的人工合成高分子材料,其临床应用已获得美国FDA批准,是周围神经损伤修复首选的生物材料,然而由于其表面的疏水性特点限制了其应用。研究表明细胞不易在疏水性材料上黏附增殖,而更偏爱生长在亲水性材料上。因此,将单甲氧基聚（乙二醇）（mPEG）,这一隐形聚合物作为亲水外壳与PLGA结合,可以显著增加材料表面的亲水性进而解决细胞不易在PLGA上黏附增殖的缺点。此外,增加了亲水性的mPEG-PLGA共聚物可以作为疏水性药物的载体,在局部释放药物,目前已用于肿瘤、非酒精性肝病等疾病的治疗,取得很好的效果。尚未见用于治疗周围神经损伤。周围神经损伤后,远端发生瓦勒氏变性,产生大量的髓鞘及轴突碎片。这些碎片被认为是阻碍轴突再生的主要障碍,因此加快碎片清除可极大的促进周围神经再生。也就是说碎片清除的速率和程度对神经损伤后轴突再生是至关重要的。在清理碎片的病理性过程中细胞自噬现象发挥着关键作用。自噬,是一种细胞自身分解损伤或衰老细胞自我吞噬的过程。雷帕霉素（Rapa）作为一种自噬激动剂通过抑制相关分子的磷酸化来起到促进自噬的作用,已引起越来越多学者的关注。Rapa可以通过自噬作用促进轴突及髓鞘碎片的清除,进而加快瓦勒氏变性的过程,达到促进周围神经的再生的作用。此外,研究表明Rapa具有保护受损神经元的作用和周围神经损伤后防止病理性疼痛的潜能。然而,雷帕霉素极强的全身副作用和高疏水性限制了其应用。因此,将雷帕霉素负载在亲水性生物材料中以达到局部释放的目的,是一种减轻其副作用、提高其利用率的有效方法。研究目的:本研究用相分离技术和原料共混方法将雷帕霉素这种高疏水药物负载在mPEG-PLGA这一复合亲水性可降解高分子膜上,包裹在周围神经横断伤吻合口处,构建可局部释放药物神经再生空间,达到促进周围神经再生效果。研究方法:1、制备mPEG-PLGA膜和Rapa-mPEG-PLGA膜2、mPEG-PLGA膜及Rapa-mPEG-PLGA膜化学性质:为了证明药物被成功负载在膜中,傅里叶红外光谱仪检测Rapa-mPEG-PLGA膜中是否含有Rapa特征性官能团。3、膜表面形貌的观察:扫描电镜（SEM）下观察比较载药膜与非载药膜之间,以及不同药物含量载药膜的表面形貌的变化。4、药物负载率和包封率测量:运用紫外-可见分光光度计（UV）,测量负载不同药物含量膜的载药率和包封率。5、膜的亲疏水性的测量:水接触角测量仪器测量水接触角（WCA）。比较载药膜与非载药膜之间,不同药物含量载药膜正反面亲疏水性。6、mPEG-PLGA膜及Rapa-mPEG-PLGA膜细胞毒性实验:CCK-8试剂盒检测mPEG-PLGA膜及Rapa-mPEG-PLGA膜对RSC96细胞的毒性。7、药物的体外释放测量:将Rapa-mPEG-PLGA膜裁剪合适大小,浸入PBS放入水平摇床中,每24h取1m LPBS利用高效液相法测定药物释放量,绘制药物释放曲线。8、建立坐骨神经神经横断伤模型,将膜包裹在神经吻合口处,术后4、8、12周评价坐骨神经再生情况。8.1坐骨神经指数（SFI）:步态分析计算SFI,评价运动功能恢复情况。8.2神经电生理检测:用肌电图检测坐骨神经再生神经的传导速度（NCV）和复合肌肉动作电位（CMAP）波峰。8.3免疫荧光（IF）:用Anti-S100β和Anti-NF-H对坐骨神经组织进行双染,检测雪旺细胞和神经丝的再生情况。8.4甲苯胺蓝（TB）及透射电镜（TEM）:计算再生神经的数量及G-ratio,从形态学角度评估神经再生的情况。8.5腓肠肌的湿重及形态学检测:计算腓肠肌湿重率,Masson染色进一步计算肌纤维的占比,评估再生神经效能。结果:1、制备出mPEG-PLGA膜和负载不同含量的Rapa的mPEG-PLGA膜:1.25%、2.5%、3.75%Rapa-mPEG-PLGA膜。2、傅里叶红外提示了,2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜能看到Rapa在1620cm-1双键C=C伸缩振动峰,随着Rapa含量增加,特征峰逐渐明显。3、扫描电镜下可见膜正面光滑、反面多孔略粗糙,膜之间在表面形貌方面无明显区别。4、mPEG-PLGA膜正面水接触角为55.2°±1.82,反面水接触角为56.8°±2.07,随着药物含量的增加,1.25%、2.5%、3.75%Rapa-mPEG-PLGA膜组膜的反面接触角数值增加到68.0°±3.37,74.3°±1.59和83.2°±4.40。5、紫外-可见分光光度计测定药物的负载率和包封率,1.25%、2.5%、3.75%Rapa-mPEG-PLGA膜药物负载率分别为0.71%,2.21%,和3.29%,包封率分别为57.6%,90.9%和91.1%。6、CCK-8法测量材料的细胞毒性,mPEG-PLGA膜,1.25%、2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜细胞活力未见明显下降,而3.75%Rapa-mPEG-PLGA膜在与RSC96细胞共培养24h、48h后,细胞活力下降至88.46%±1.63%,85.70%±0.84%。7、高效液相法测量药物每日释放量,绘制药物释放曲线。药物持续释放10天左右,前8天持续均匀释放,后缓慢平稳释放至每日释放量过少测不出。结合上述所有实验,选用2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜进行下一步动物实验。8、步态分析,术后4、8、12周,相比直接吻合对照组,2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜组SFI明显降低,提示运动功能恢复较好。9、神经电生理检测,术后8、12周,与对照组相比2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜组CMAP峰值和NCV升高更明显,提示神经功能明显恢复。10、甲苯胺蓝显示术后8、12周,相比对照组,2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜组再生髓鞘数量明显增加。术后4、8、12周,mPEG-PLGA膜和2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜组与对照组相比G-ratio数值更小,且术后4周,2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜组比mPEG-PLGA膜组G-ratio数值更小,提示髓鞘更成熟。11、腓肠肌湿重率提示,与对照组相比,2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜组湿重率明显增加。通过Masson染色计算肌纤维占比,术后4、8、12周,mPEG-PLGA膜及2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜组相比对照组,肌纤维占比程度更高,同时,术后12周,2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜组相比mPEG-PLGA膜肌纤维占比程度更高,提示肌肉萎缩程度明显减轻。研究结论:1、采用相分离技术和原料共混技术可将Rapa成功负载在mPEG-PLGA膜中,制备出不同药物含量的Rapa-mPEG-PLGA膜。其中,2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜亲水性良好,适宜细胞生长,且对细胞无明显毒性。2、2.5%Rapa-mPEG-PLGA膜可有效促进大鼠坐骨神经损伤后的神经再生,再生神经形态和功能良好。