一、研究目的:临床上,许多疾病的发生如应激性疾病、放化疗引起的骨髓抑制、激素治疗副作用及艾滋病等都与淋巴细胞异常凋亡密切相关。淋巴细胞作为机体主要的免疫细胞,是机体免疫功能强弱的物质基础,关系到机体内环境的稳定性,其功能状态正常与否有许多的疾病的发生、发展、转归及预后密切相关。而现代免疫药理研究和临床实验证明,许多补益中药及其有效提取成分具有明显的免疫增强和免疫调节作用,对多种免疫功能低下症的治疗也具有显著疗效。因此,研究和开发与免疫性疾病相关的药物,如免疫增强剂或免疫调节剂,尤其是抗免疫细胞异常凋亡的药物,也成为当今医学领域研究的热点。胸腺是机体的中枢免疫器官,是T淋巴细胞的分化成熟的场所,其功能状态的好坏直接关系到整个机体的免疫功能。本实验研究利用糖皮质激素类药物诱导小鼠胸腺细胞异常凋亡建立凋亡模型,研究黄芪注射液、枸杞多糖、虫草菌丝多糖、黄芪多糖、灵芝多糖五种补益药物活性成分对小鼠胸腺细胞异常凋亡的干预作用,以期揭示它们的新的免疫药理作用及其作用机制,同时也为临床新药开发提供实验依据。二、方法:1.采用腹腔注射DEX方法建立凋亡模型选取18-22克NIH小鼠,雌雄各半随机分为对照组和2h、4h、6h、8h、10h模型组,每组8只。采用临床用地塞米松磷酸钠注射液(DexamethasoneSodium Phosphate injection,DEX)二十倍稀释液进行小鼠腹腔注射,0.2ml/只,对照组腹腔注射生理盐水0.2ml/只,各造模组分别于2h、4h、6h、8h、10h后取各组小鼠胸腺细胞,与正常组小鼠胸腺细胞进行细胞涂片,然后进行Gimsa染色,通过形态学计数法观察并计数每只小鼠胸腺细胞凋亡数及凋亡率,然后求各组的平均凋亡率,绘制时间—凋亡曲线。2.中药活性成分对淋巴细胞活异常凋亡的干预作用采用MTT法和Giemsa染色法测定吸光值和凋亡细胞数来计算各实验组细胞的细胞活性及凋亡率,分析黄芪注射液、枸杞多糖、灵芝多糖、黄芪多糖和虫草菌丝多糖对糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞异常凋亡的干预作用,从上述五种药物中初步筛选出对小鼠胸腺细胞凋亡有抑制作用的药物,进行深入的药效学研究。3.初筛有效药物对细胞凋亡抑制作用的流式细胞仪分析采用流式细胞术以PI单染和AnnexinV—FITC/PI双染法进一步检测上述初步筛选的有效药物对细胞凋亡率的影响,以定量检测各组细胞凋亡率。4.琼脂糖凝胶电泳实验分析有效药物对细胞凋亡的抑制作用本实验通过琼脂糖凝胶电泳方法从细胞凋亡生化特征方面分析上述初筛有效药物对淋巴细胞凋亡的抑制作用。5.抑制细胞凋亡作用机制的研究采用免疫组织化学技术和western blot技术分析上述有效凋亡抑制药物对小鼠胸腺细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Caspase-3表达的影响,初步探讨其抑制淋巴细胞异常凋亡的分子机制。三、结果:1.成功建立小鼠胸腺淋巴细胞异常凋亡模型从实验数据和时间—凋亡曲线图上观察,6h组小鼠胸腺细胞凋亡率最高。琼脂糖凝胶电泳结果显示:各模型组条带均出现典型的的细胞凋亡DNA Ladder条带,而正常组仅出现单一性条带,说明本实验造模成功.2.黄芪注射液和枸杞多糖可以抑制糖皮质激素诱导的小鼠胸腺细胞的凋亡通MTT法和Gimsa染色法结果分析显示:黄芪注射液高、中、低剂量组对糖皮质激素作用下的胸腺细胞生存活性或凋亡率有明显的增强或抑制作用(P<0.01或P<0.05,与模型组比较),且呈显剂量依赖关系的趋势,以高剂量效果最好;枸杞多糖高、中、低剂量组对糖皮质激素作用下的胸腺细胞生存活性或凋亡率也有增强或抑制作用(P<0.01或P<0.05,与模型组比较),但无剂量依赖关系,其中剂量效果较好。3.流式细胞术分析初筛有效药物对DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的抑制作用不论PI单染还是双染色法,流式细胞仪器结果显示:黄芪注射液和枸杞多糖对小鼠胸腺细胞的异常凋亡有明显的抑制作用。其中,黄芪注射液高、中、低剂量组细胞凋亡率分别为:PI单染2.50%±0.10%、5.67%±1.11%、9.40%±1.31%(P<0.01,与模型组比较);双染法3.13%±0.25%4.60%±0.44%、5.13%±0.45%(P<0.01或P<0.05,与模型组比较),其中高剂量组凋亡率最低,且有剂量依赖性趋势。而枸杞多糖高、中、低剂量组凋亡率分别为:PI单染15.2%±1.66%、11.36%±0.72%、18.5%±1.76%(P<0.01,与模型组比较);双染法4.27%±0.15%、3.53%±0.24%、5.60%±0.50%(P<0.01或P<0.05,与模型组比较),其中中剂量组凋亡率最低,且随剂量升高或降低凋亡率都有上升的趋势。4.琼脂糖凝胶电泳实验如正文图7、8所示。黄芪注射液和枸杞多糖实验的正常组未见典型的凋亡DNA Ladder条带,而模型组均出现较典型的Ladder条带。黄芪注射液高、中、低剂量组均有DNA Ladder条带出现,但高剂量组与模型组比较条带不明显。枸杞多糖高,中,低剂量组也均有典型凋亡条带出现,中剂量组与模型组比较条带不明显。5.机制研究免疫组化技术和Western Blot技术分析黄芪注射液和枸杞多糖对小鼠胸腺细胞Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响,结果显示:(1)黄芪注射液实验免疫组化结果显示,与模型组比较,黄芪注射液各剂量组凋亡抑制基因bcl-2蛋白的阳性面积百分比均增加(p<0.01),而Caspase-3蛋白的阳性面积百分比则减少(p<0.01),均呈现剂量依赖关系;Western Blot蛋白条带的灰度值分析显示:黄芪注射液高、中、低剂量组及模型组Bcl-2蛋白相对表达量分别2.20、1.77、1.69、1.29;而黄芪注射液高、中、低剂量组及模型组Caspase-3蛋白条带的灰度值分别为1.18、1.25、1.40、2.23。结果提示,黄芪注射液具有促进凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,而下调Caspase-3过度表的的作用,且表现出一定的剂量依赖关系。(2)枸杞多糖实验免疫组化结果显示:与模型组比较,枸杞多糖各剂量组Bel-2蛋白的阳性区域面积较大,差异有统计学意义p<0.01,且中剂量组阳性面积最大;而枸杞多糖各剂量组与模型组比较,Caspase-3蛋白的阳性区域面积则变小,差异有统计学意义p<0.01或p＜0.05。Weatern Blot结果显示,枸杞多糖高、中、低剂量组与模型组的Bcl-2蛋白相对表达量分别为:2.31、2.34、1.18、2.11,其中以中剂量组灰度值最大;而各剂量组及模型组Caspase-3蛋白相对表达量分别为1.70、1.26、1.59、2.1,且以中剂量组最小。结果提示,枸杞多糖具有促进凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,而下调促凋亡蛋白Caspase-3过度表达的的作用,但无剂量依赖关系,以中剂量效果最好。四、结论:本研究采用DEX成功建立小鼠胸腺细胞凋亡模型,利用MTT法、Giemsa染色法、流式细胞术及琼脂糖凝胶电泳法分析黄芪注射液、枸杞多糖、灵芝多糖、黄芪多糖、虫草菌丝多糖对DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡的干预作用,并通过Western Blot和免疫组化技术探讨上述有效药物对细胞凋亡抑制作用的分子机制。研究结果表明,黄芪注射液和枸杞多糖均能抑制DEX诱导的小鼠胸腺淋巴细胞的异常凋亡,其中以黄芪注射液高剂量组效果最好,且有剂量依赖关系的趋势。而枸杞多糖则以中剂量组效果显著,高、低剂量组效果较差。它们的作用机制一部分可能是通过促进抗凋亡基因bcl-2的表达,抑制促凋亡基因caspase-3的表达来实现的,但不排除其他作用机制,可能联合其它的机制抑制凋亡,这还有待进一步的研究。