【摘 要】
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牦牛是青藏高原上的主要畜种,素有高原之舟的美誉,对于青藏高原极端环境具有杰出的适应能力,但其生产性能显著低于普通牛。通过长期的生产实践,人们发现普通牛(父本)和牦牛(母本)之间跨物种的杂交后代在生产性能及役用能力方面均有明显的杂种优势,F1代杂种,即犏牛除了在产奶产肉性能均得到极大提升外,对青藏高原恶劣环境具有与牦牛同样的适应能力。但在跨物种杂交育种实践中,由于F1代犏牛雄性不育导致其优良基因组合
【基金项目】
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中央高校基本科研业务费专项资金项目(2020NZD04); 西南民族大学研究生创新课题(CX2020SZ33);
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牦牛是青藏高原上的主要畜种,素有高原之舟的美誉,对于青藏高原极端环境具有杰出的适应能力,但其生产性能显著低于普通牛。通过长期的生产实践,人们发现普通牛(父本)和牦牛(母本)之间跨物种的杂交后代在生产性能及役用能力方面均有明显的杂种优势,F1代杂种,即犏牛除了在产奶产肉性能均得到极大提升外,对青藏高原恶劣环境具有与牦牛同样的适应能力。但在跨物种杂交育种实践中,由于F1代犏牛雄性不育导致其优良基因组合无法通过横交固定,因此极大限制了牦牛杂交育种进程。近年来,关于雄性犏牛不育的研究主要基于睾丸组织形态、基因组学、蛋白组学、转录组学和表观遗传学等领域,尚未有犏牛睾丸细胞学研究的相关报导。在小鼠、猪、山羊、水牛等物种中,已有睾丸细胞体外培养、体外授精和胚胎移植等相关报导,这些研究为犏牛睾丸细胞学特征的研究及其雄性不育机制的解析提供了相关参考,犏牛睾丸细胞学的深入研究将为研究犏牛不育难题克服提供新的思路。本研究以F1代公犏牛作为实验组,以麦洼牦牛公牛为对照组。通过兽医外科手术摘取两牛种睾丸组织进行玻璃化冷冻处理保存,冷冻组织复苏后通过混合酶消化和差速贴壁培养,然后将贴壁细胞分离和饥饿处理后获得睾丸支持细胞,将悬浮细胞离心处理后获得睾丸生精细胞。在此基础上,体外培养犏牛和牦牛睾丸生精细胞和支持细胞并优化两类细胞体外培养体系,并进行两类细胞体外增殖检测、细胞标记基因及蛋白检测和生精细胞体外诱导分化等试验,通过比较分析细胞表型、增殖分化潜能及其相关基因蛋白表达解析了牦牛与犏牛睾丸细胞生物学特征差异,为雄性犏牛不育机制的阐明提供了新的线索和资料。本研究获得具体结果如下:1.本研究分离纯化了牦牛与犏牛睾丸支持细胞,鉴定并比较分析了两牛种睾丸支持细胞在表型特征、基因表达和体外增殖潜能的差异。建立了体外培养的方案,经细胞形态、特殊染色、标志基因检测鉴定,成功分离得到牦牛与犏牛睾丸支持细胞。两种牛睾丸支持细胞具有相似的形态特征,但犏牛支持细胞体外增殖能力弱于牦牛,同时促精原干细胞自我更新及增殖基因GDNF、睾丸发育相关基因SOX9、支持细胞增殖相关基因TGF-β1、支持细胞标志基因WT1在犏牛睾丸支持细胞中低表达。针对丝裂霉素C的处理,随着培养时间延长,两种牛睾丸支持细胞均出现细胞形态的改变,胞质有白色空泡,细胞核质不明显,且牦牛睾丸支持细胞整体存活数目、胞质空泡情况优于犏牛,提示犏牛睾丸支持细胞这些缺陷可能是犏牛雄性不育的部分原因。2.本研究分离纯化了牦牛与犏牛生精细胞,鉴定并比较分析了两种牛生精细胞在表型特征、基因蛋白表达和体外增殖潜能的差异。牦牛和犏牛冷冻睾丸组织经混合酶消化、差速贴壁后,收集悬浮细胞分离纯化牦牛及犏牛睾丸生精细胞。通过显微成像及细胞计数,发现处理同样质量睾丸组织,牦牛睾丸生精细胞的得率远高于犏牛,同时精母细胞的比率更高,而犏牛精原细胞的占比更高。生精细胞通过DDX4免疫荧光鉴定,使用含生长因子、饲养层、KSR(Knockout serum replacement)血清替代物、各类氨基酸等混合体系培养生精细胞,优化各组分比例并建立了生精细胞的体外培养方案,并通过EDU、CCK8及细胞克隆集落形成成像的方法予以证实细胞体外增殖活性。通过EDU与未分化精原细胞标志物GFRa1、PLZF共染的方式,发现具有增殖活性的生精细胞多为未分化精原细胞。精原细胞增殖相关基因GFRa1和Thy-1调控精原干细胞分化与自我更新基因PLZF在犏牛生精细胞中低表达。犏牛睾丸生精细胞相对于牦牛,存在增殖能力、基因蛋白表达方面的缺陷,提示其生精障碍的部分原因。3.本研究揭示了犏牛生精细胞体外分化潜能相对牦牛弱,且启动减数分裂关键因子的基因和减数第一次分裂早前期相关基因蛋白在犏牛表达下调或不表达。添加30ng·μL-1维甲酸同时进行牦牛及犏牛睾丸生精细胞的体外诱导,发现犏牛生精细胞对维甲酸诱导反应性低,仅有维甲酸直接下游分子STRA8表达上调,其它减数分裂相关基因SYCP3、Boll、DAZL、Acrosin基本无表达,且经维甲酸诱导后不上调。牦牛生精细胞针对维甲酸的刺激具有较强的反应性,减数分裂相关基因BOLL、DAZL、SYCP3等表达量升高,SYCP3蛋白水平也有所上调。提示在体外培养过程中,针对维甲酸的诱导,相对于牦牛生精细胞,犏牛生精细胞具有较低反应特性,细胞分化能力低。
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