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中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)是目前已发现的六种人冠状病毒中自严重急性呼吸系统综合症(Sever acute respiratory syndrome,SARS)以来的的第二种高致病性人冠状病毒,截至2018年3月,世界卫生组织(World Health Organization,WHO)数据显示超过27个国家报告了 MERS病例,其中有2189例实验室确诊病例,782例死亡病例,高达35%的病死率。迄今尚无有效的预防性疫苗与抗病毒药物的应用是报道。借鉴被动免疫治疗及人源中和单抗在新发传染病应急治疗中的应用报道,多项研究提示应用MERS-CoV特异性人源中和抗体已被认为是有效的治疗方案选项。目前国内外在MERS-CoV特异性人源中和抗体研究上虽有一定进展,但大多数人源抗体中和活性不强,仍需研发获得更多更强的MERS-CoV特异性人源中和抗体,并对其中和表位与分子机制进行更全面深入的分析,为疫苗研发及中和抗体的临床应用提供基础。在这项研究中,我们从2015年中国首例输入性MERS-CoV感染的恢复期病人全血中分离扩增B细胞,首先通过ELISA筛选其中能够编码特异性结合MERS-CoV棘突蛋白抗体基因的克隆孔,再应用MERS-CoV-S假病毒中和实验分析结合阳性孔的中和活性并分组,采用RT-PCR技术将中和强阳性(大于90%)B细胞中的抗体可变区克隆到表达载体中,并通过测序技术进行免疫遗传学(IMGT/V-QUEST)分析。将同孔或异孔中VH和VL/VK克隆基因配对瞬时共转染到HEK-293T细胞中表达纯化,获得靶向中和MERS-CoV S蛋白的人源单克隆抗体库。随后,我们通过S蛋白结合ELISA与假病毒中和实验对人源单克隆抗体库进行体外功能分析,并采用竞争ELISA、表面生物膜干涉技术、假病毒突变株、MERS-CoV真病毒噬斑中和实验等对其中体外中和活性最强的两种人源单抗(MERS-GD27和MERS-GD33)进行功能分析验证,并进一步采用抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)实验、抗体依赖增强作用(ADE)实验、hu-DPP4转基因小鼠预防与治疗实验、单抗与RBD复合物晶体结构分析等对MERS-GD27进行了体内外功能与结构研究。我们的主要研究结果如下:1)通过B细胞分离技术,从MERS-CoV恢复期病人PBMC中分离2880孔B细胞,酶联免疫吸附法(ELISA)筛选测定其中有82个B细胞培养上清液对MERS-CoV S蛋白呈现阳性反应(占总体的2.85%),其中11个孔显示抗MERS-CoV S假病毒最强的中和活性(IR ≥90%,占总体的13.41%),68个孔显示具有中等的假病毒中和活性(50%≤IR<90%,占总体的82.93%),3个孔显示具有弱的假病毒中和活性(30%≤IR<50%,占总体的3.66%)。2)通过PCR扩增及克隆技术,我们从11孔强中和活性的B细胞中获得了110个重链(VH)质粒和220个轻链(VL)质粒。通过测序技术及IMGT/V-QUEST分析,具有强健中和活性的抗体基因谱显示出16种编码重链抗体基因的种系基因,16种编码Lambda链抗体基因的种系基因以及9种编码Kappa链抗体基因的种系基因。其中筛选到的22株强中和活性的mAb的重链基因型主要来源于IGHV1-69,并组合6种不同的轻链基因型。中和抗体基因VH区段显示非常低水平的体细胞超突变(SHM),范围从0到仅有3个氨基酸突变。VH互补决定区3(CDR3)的长度从16到18个氨基酸不等。然而,VL基因更多样化,SHM的范围为0至11个氨基酸的改变。3)配对表达并纯化制备了 22株抗MERS-CoV人源中和单克隆抗体,皆与S蛋白具有较强的结合活性,其中13株为同孔来源的单抗,有9株是异孔来源的单抗。假病毒中和实验分析显示其中15株人源单抗显示出超强的中和活性(IC50值≤ 0.005 μg/ml)。这些抗体重链种系基因皆为IGHV1-69。来源于同一孔的VH种系基因与不同VL配对时可显示出不同程度的中和活性。4)两株同孔来源的人源单抗MERS-GD27和MERS-GD33在体外中和实验中显示出最强的中和活性(与已报道的中和活性最强的人源抗MERS-CoV中和单抗m336相当),假病毒IC50值分别为0.0010 μg/ml和0.0013μg/ml。真病毒中和实验(PRNT)结果与假病毒中和实验结果相似,抗体浓度为0.001 μg/孔时可对MERS-CoV感染具有明显的中和抑制。5)MERS-GD27和MERS-GD33分别与MERS-CoV-S蛋白显示出亚纳摩尔亲和力[表观解离常数(Kd)值分别为0.775 nM和0.575 nM]。根据与MERS-GD27或MERS-GD33的竞争结合活性的强度(高、中、低),可以将13株mAbs分成三个不同的组,识别MERS-CoV上的不同表位。MERS-GD27和MERS-GD33与MERS-CoV S蛋白具有低水平的竞争结合活性(<20%),因此表明两株单抗具有不同的结合表位。其他11株单抗与生物素标记的上述两株单抗表现出差异的竞争结合活性。6)MERS-GD27和MERS-GD33在与15株MERS-CoV假病毒及其突变株中和实验中显示出广谱有效的中和活性。MERS-GD27或MERS-GD33能够完全中和10株S蛋白突变体MERS-CoV假病毒。MERS-GD27在五种 S 蛋白突变(L506F,D509G,V534A,E536K 和 A556V)假病毒中和实验中,显示出较弱的中和活性。MERS-GD33与MERS-GD27结果有所不同,MERS-GD33可以有效中和E536K突变株假病毒,但不能有效中和五种S蛋白突变(L506F,D509G,V534A,R511P和A556V)假病毒。7)组合抗体(MERS-GD27和MERS-GD33)在体外假病毒中和实验中显示出强协同作用8)MERS-GD27抗体不能激活NK细胞,因此在体外不能诱导ADCC作用;且不能产生ADE效应。9)通过转基因小鼠验证了尾静脉注射5 mg/kg的MERS-GD27对感染致死量(3 LD50)病毒的小鼠具有明显的预防性和治疗性保护性作用。10)MERS-GD27 Fab与MERS-CoV RBD蛋白复合物晶体结构分析表明:MERS-GD27结合表位与受体结合位点几乎完全重叠,提示其与m336具有部分保守的中和机制。综上所述,我们探索了从自然感染中东呼吸综合征冠状病毒恢复期病人中获得抗MERS-CoV人源中和抗体库的技术方案,成功获得22株超强人源单克隆抗体并分析其免疫遗传学与体外生物学特性,进一步系统分析了其中2株超强人源单克隆抗体(MERS-GD27和MERS-GD33)的生物学功能及作为候选治疗方案的潜力,探讨了 MERS-GD27中和作用的结构机制。我们的研究将为阻断MERS-CoV感染提供新的理论借鉴与技术支持。