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研究背景食管癌是全球第六大癌症相关致死因素,也是严重威胁人类健康的疾病之一。食管癌按照组织学主要可分为两大类型:食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）与食管腺癌（Esophageal adenocarcinoma,EAC）。据统计,ESCC占全球所有食管癌病例的90%,并且主要发生在亚洲,东非和南美。中国是ESCC的高发地区,全世界将近50%的ESCC病例发生在中国。早期ESCC可经由内镜下消融术进行治疗,而以手术与放化疗为主的综合治疗是大部分ESCC患者的主要治疗方案。ESCC晚期容易发生远处转移,是引起患者病情进展进而导致预后不良的重要因素之一。因此,研究影响ESCC转移的潜在机制并探究潜在的分子治疗靶点,对于提高ESCC患者生存率与改善预后具有重要意义。核糖体S6蛋白激酶4（Ribosomal S6 Kinase 4,RSK4）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶,属于RSK家族。RSK4是我们课题组一直关注的一种蛋白激酶。前期的研究中我们发现RSK4在ESCC中高表达并在促进放疗抵抗,侵袭转移,增强肿瘤干性中发挥着重要作用。作为一种ESCC发生发展中潜在的“癌蛋白”,前期我们研究发现ΔNp63作为一种转录因子可以转录激活RSK4表达,进而在转录水平上调控RSK4表达水平。考虑到细胞内蛋白表达水平除了受到转录调控之外,蛋白的翻译后修饰特别是蛋白的泛素化修饰并经由蛋白酶体途径降解也是调控细胞内蛋白水平的重要机制。而截止目前为止,关于RSK4蛋白的泛素化修饰机制仍不明确。因此,这引发我们对RSK4泛素化修饰的机制研究。泛素化修饰是重要的蛋白翻译后修饰方式之一,已被证实参与了人类多种肿瘤的发生发展过程。E3泛素连接酶是介导蛋白发生泛素化修饰的重要调节因子。FBXW7（F-box and WD repeat domain-containing 7）是一种经典的SCF型E3泛素连接酶,被发现参与了细胞内多种靶蛋白的降解过程。由于越来越多的“癌蛋白”被鉴定为FBXW7的靶标底物,因此,普遍认为FBXW7是一种重要的抑癌因子,在各大人类肿瘤中发挥着抑癌作用。研究表明,FBXW7在多种人类肿瘤中存在突变缺失,和表达下调,进而导致多种“癌蛋白”在细胞内富集,最终促进了肿瘤的发生发展。FBXW7在ESCC中突变率大约为5%,并认为这种突变具有潜在的预后与临床治疗意义。但是关于FBXW7在ESCC中具体作用机制尚不清楚。有趣的是,我们通过比对RSK4蛋白序列与经典的FBXW7识别基序,意外地发现RSK4含有FBXW7潜在的识别位点。那么,RSK4作为一种ESCC发生发展中重要的“癌蛋白”,RSK4是否为FBXW7潜在新底物?FBXW7又能否泛素化修饰RSK4并在翻译后水平参与调控RSK4的蛋白稳定性进而参与ESCC的发生发展过程?因此本课题拟探究FBXW7在ESCC中的表达情况及其临床意义,并深入探讨FBXW7泛素化修饰RSK4并诱导其经由泛素-蛋白酶体途径降解的潜在作用机制,进而阐明FBXW7表达水平及其在ESCC中发挥的潜在作用,希望为未来ESCC的临床治疗提供新的思路与治疗靶点。目的1.明确FBXW7在ESCC组织及相关细胞系中的表达情况以及与RSK4表达相关性;2.探究FBXW7表达情况与ESCC患者临床病理因素以及预后的关系;3.探究FBXW7对ESCC细胞侵袭迁移表型的影响;4.探究FBXW7识别并诱导RSK4泛素化降解的作用机制;5.探究FBXW7介导的RSK4泛素化降解机制对ESCC细胞转移的影响。方法1.使用Oncomine数据库分析FBXW7在ESCC和正常食管上皮细胞表达差异。通过免疫组化染色分析FBXW7在ESCC和对应癌旁组织的表达差异;2.应用Western blot技术检测新鲜ESCC手术切除标本和ESCC细胞系中FBXW7与RSK4的表达情况。利用免疫组化染色检测ESCC患者石蜡组织切片中FBXW7与RSK4表达情况,并分析FBXW7与RSK4的表达相关性;3.收集ESCC患者相关病例信息,并分析FBXW7表达与ESCC患者临床病理特征及其预后的关系;4.使用免疫共沉淀探究FBXW7与RSK4可能存在的相互作用关系。进一步利用质粒转染技术,蛋白质半衰期实验和泛素化实验,探究FBXW7泛素化修饰RSK4并诱导其经由蛋白酶体途径降解的作用机制;5.应用GSK3β抑制剂初步探究GSK3β激酶对FBXW7介导的RSK4泛素化降解的影响;6.利用慢病毒感染技术过表达或敲除FBXW7并应用外源性转染技术同时过表达RSK4或敲低RSK4,进一步使用划痕实验,Transwell实验,以及裸鼠肺转移模型探究FBXW7诱导RSK4泛素化降解机制对ESCC转移表型影响。结果1.Oncomine数据库分析发现:相比于正常食管上皮组织,FBXW7在ESCC中呈现低表达。ESCC组织芯片结果显示FBXW7在ESCC中的表达水平低于其配对的癌旁正常组织;2.FBXW7表达下调与ESCC患者淋巴结转移,血管侵犯有关。生存分析结果提示FBXW7低表达患者预后较差,多因素COX回归分析发现FBXW7是ESCC独立的预后影响因素;3.在ESCC细胞与组织水平中FBXW7与RSK4的蛋白表达呈现负相关趋势;4.FBXW7可以靶向泛素化修饰RSK4并诱导其经由泛素-蛋白酶体途径降解;5.GSK3β参与了FBXW7介导的RSK4泛素化降解过程。使用GSK3β抑制剂可以影响FBXW7与RSK4的相互结合;6.外源性提高FBXW7表达水平可抑制ESCC肿瘤细胞的侵袭转移,敲除FBXW7可增强ESCC肿瘤细胞的侵袭转移。挽救实验进一步证实,FBXW7介导的RSK4泛素化修饰作用在调控ESCC转移中发挥重要作用。结论1.相比于正常食管上皮,FBXW7在ESCC中表达下调,并且与淋巴结转移,血管侵犯相关。FBXW7低表达提示预后不良,多因素生存分析显示FBXW7是ESCC患者独立的预后影响因素;2.FBXW7与RSK4蛋白表达水平呈现负相关趋势,RSK4是FBXW7新的靶标蛋白,FBXW7可以与RSK4发生相互结合,并泛素化修饰RSK4最后诱导其经由泛素-蛋白酶体途径降解;3.在ESCC中,FBXW7存在缺失或表达下调,导致其介导的RSK4泛素化修饰作用减弱或缺失,从而增强了RSK4的蛋白稳定性,进而促进了ESCC转移。在蛋白翻译后调控水平上部分解释了FBXW7的缺失或低表达是维持ESCC中RSK4高表达的潜在机制,为未来治疗和改善ESCC预后提供了新的潜在分子治疗靶点。