论文部分内容阅读
柯萨奇病毒(Coxsackie Virus,CV)是一种人类病毒,其归属在小RNA病毒科(Picornaviridas)中的肠道病毒属(Enterovirus,EV)。本研究中用到的是柯萨奇病毒的一种很重要的亚型之一,柯萨奇病毒B组3型病毒(coxsackievirus B3,CVB3)。它在临床上能引起急慢性心肌炎和胰腺炎,发病率和病死率很高,特别是对于婴幼儿及新生儿来说是高易感疾病[1],新生儿及幼儿的病患较多,严重威胁着婴幼儿的健康及生存。虽然成人患病相对较少,但是一旦发病,同样非常严重,而且至今没有特效的药物或防治措施。因此,本研究针对CVB3感染的防治策略进行了探索,希望能探究出一条新的比较有效的防治途径。本研究首先用基因合成、拼接等分子生物学实验方法对天然Caspase-3进行了改造,设计出了含3C蛋白酶酶切位点的Caspase-3的基因,成功构建了3C蛋白酶.重组Caspase-3细胞凋亡通路,利用3C蛋白酶的酶切活性在细胞内激活Caspase-3信号凋亡通路,从而诱导感染细胞发生凋亡。该工作分别构建了真核表达载体,即质粒、腺病毒表达载体和慢病毒表达载体,递送入哺乳细胞内,检测了其表达产物及细胞毒性。之后分别在哺乳动物细胞及Balb/c乳鼠上进行防治CVB3感染效果的验证。结果显示,重组Caspase-3对细胞感染CVB3具有保护作用,并且对Balb/c乳鼠感染CVB3也具有保护作用。同时,为了这条途径最终能应用于人类病毒感染的防治,以求找出最佳的基因载体能起到更好的防治病毒的效果。我们对Caspase-3进一步地改造,成功构建了质粒pcDNA3.1(+)-recombination-signal peptide-caspase-3-6Aa(以下简称为p-rc-sig-6),又相继获得了含有改造Caspase-3的基因的腺病毒基因载体Ad-recombination-Caspase-3-6Aa( 以下简称为Ad-rc-6)和Ad-recombination-Caspase-3-8Aa(以下简称为Ad-rc-8)及慢病毒基因表达载体LV-recombination-signal peptide-Caspase-3-6Aa(以下简称为LV-rc-sig-6)。我们首先在哺乳动物细胞上进行了质粒、腺病毒基因载体及慢病毒基因载体的表达验证及抑制病毒感染的验证,继而又在乳鼠身上进行了腺病毒基因载体及慢病毒基因载体抑制病毒感染的验证,证实了这条通路是可行的,并且还具有广泛的实用性。我们在此做出了一些探索,希望能为以后这条通路应用于临床实验提供一些参考。这条通路的提出,为CVB3感染的防治及其治疗药物的研发提供了新的途径和思路,同时也为其它病毒的防治方法提供了借鉴意义,具有十分广阔的应用前景。