【摘 要】
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研究背景:2020年世卫组织全球健康评估显示:1990年到2019年,心血管疾病是全球死亡的首要原因。其中,缺血性心脏病作为主要的心血管疾病,是造成心肌损伤的最常见的原因。及时和完全的再灌注能有效挽救受损的心肌,是心肌缺血首要的治疗目标,但再灌注本身又会造成进一步损伤,称为“缺血/再灌注损伤”。既往研究表明,PI3K-Akt信号通路是机体重要的心肌保护通路。p85α和p55γ均是IA类PI3K的调
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研究背景:2020年世卫组织全球健康评估显示:1990年到2019年,心血管疾病是全球死亡的首要原因。其中,缺血性心脏病作为主要的心血管疾病,是造成心肌损伤的最常见的原因。及时和完全的再灌注能有效挽救受损的心肌,是心肌缺血首要的治疗目标,但再灌注本身又会造成进一步损伤,称为“缺血/再灌注损伤”。既往研究表明,PI3K-Akt信号通路是机体重要的心肌保护通路。p85α和p55γ均是IA类PI3K的调节亚基,实验室前期研究发现p55γ可以激活Akt信号通路从而促进心肌损伤修复。而p85α是否在对抗心肌损伤中发挥作用,尚未有研究报道。研究目的:本文旨在通过研究缺血/再灌注损伤时p85α表达含量的变化以及其在心肌损伤中的作用,并进一步探讨p85α发挥作用的分子机制,也向进一步明确心肌损伤发生发展机制和治疗提供新的研究基础。研究方法:细胞水平上:使用原代新生大鼠心肌细胞,构建缺氧/复氧（H/R）损伤模型。运用qPCR和Western blot实验检测相关分子的表达含量;评估心肌损伤主要使用三个指标:通过胞内ATP含量、培养基中LDH的含量评估细胞坏死,通过Caspase 3的活性评估细胞凋亡;通过CO-IP相关实验明确蛋白质之间的相互作用及机制。整体水平上:使用8-12周龄雄性小鼠,构建小鼠心脏缺血/再灌注（I/R）损伤模型。运用qPCR和Western blot实验检测相关分子的表达含量;评估心肌损伤主要使用三个指标:通过TTC染色、血清中LDH的含量评估细胞坏死;通过TUNEL染色评估细胞凋亡;通过泛素化检测实验探索潜在的机制。研究结果:1.缺血/再灌注损伤中心肌p85α表达含量的变化在I/R和H/R损伤刺激下,心肌p85α的蛋白含量较对照组显著增加。2.高表达或者敲减p85α对心肌损伤的影响对心肌细胞进行过表达p85α和H/R损伤,与单纯H/R损伤组相比,过表达组心肌细胞LDH的释放明显增加、细胞活性明显下降,Caspase 3的活性明显增加。相反,对心肌细胞进行敲低p85α和H/R损伤,与单纯H/R损伤组相比,敲减组心肌细胞LDH的释放明显减少、细胞活性明显增加,Caspase 3的活性明显下降。同样,p85α基因敲除小鼠的I/R损伤相比野生型小鼠明显减轻,包括梗死面积的减少、血清LDH的释放减少、TUNEL阳性细胞数量的减少。3.高表达或者敲减p85α对Akt的磷酸化的影响使用腺病毒对心肌细胞内的p85α进行过表达,结果发现过表达p85α抑制Akt的磷酸化激活。相反,敲低p85α,Akt的磷酸化水平明显增加。同样,p85α基因敲除小鼠磷酸化Akt的水平较野生型小鼠相比也显著增加。当心肌细胞同时过表达p55γ和p85α时,p55γ介导的Akt的磷酸化激活受到抑制。将心肌细胞同时过表达p55γ、p85α并联合H/R损伤,结果显示p55γ对抗H/R损伤的作用明显受到抑制。4.高表达或者敲减p55γ对p85α表达含量的影响在p55γ心脏特异性转基因鼠的心脏中,p85α的蛋白水平明显降低,m RNA水平没有明显变化,同时p85α的泛素化增强。同样,心肌细胞高表达p55γ,得到了一致的结果。相反,在p55γ基因敲除小鼠中,p85α的蛋白水平明显增加,m RNA水平没有明显变化,同时p85α的泛素化降低。进一步,过表达p55γ的心肌细胞加入蛋白酶体抑制剂β-lac或MG132,可以阻断p55γ介导的p85α的下调、Akt的磷酸化激活以及心肌保护作用。研究结论:在I/R和H/R损伤刺激下,心肌p85α的蛋白含量显著增加;心肌过表达p85α可以加重I/R损伤,而敲除p85α则减轻I/R损伤。机制上,p85α通过抑制Akt的磷酸化,加重心肌损伤;而p55γ可以通过增加p85α的泛素化,促进p85α的降解,促进Akt的磷酸化,对抗心肌损伤。
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