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背景和目的据GLOBOCAN 2020对世界肿瘤研究的数据,肺癌在全球肿瘤中的发病率和死亡率高居榜首。同时发生远处转移的肺癌病人预后较差。肺癌的发生发展和很多因素有关,表观遗传因素在肺癌中的作用也越来越受到关注。含SET结构域蛋白2（SET domain-containing 2,SETD2）是特异性负责组蛋白H3赖氨酸36三甲基化（histone H3 lysine 36 trimethylation,H3K36me3）的组蛋白甲基转移酶。其位于3号染色体短臂（short arm of chromosome3,3p）,而3p的缺失又存在于大部分的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中,SETD2的拷贝数丢失在NSCLC中也占有很大比例,同时越来越多的研究表明SETD2在NSCLC中常发生突变。这均说明了SETD2可作为抑癌基因（tumor suppressor gene,TSG）参与了NSCLC的病理过程。因此本文旨在阐明SETD2缺失是否驱动NSCLC进展影响患者预后及SETD2失活如何促进NSCLC恶性转化。了解其具体作用机制可为我们进行有效的预防和治疗策略制定提供参考。方法1.分析NSCLC患者SETD2突变、肿瘤突变负荷（tumor mutation burden,TMB）信息以及其与预后的关系。通过对145例NSCLC患者的靶向DNA测序结果和TCGA数据进行分析,探求SETD2突变、TMB对患者预后的影响。2.构建SETD2敲除（knockout,KO）的A549细胞并检测敲除效率在A549细胞中,使用基于CRISPR的载体sg RNAs（small guide RNAs）构建靶向敲除SETD2的细胞(（sg3,sg4,sg5）和非靶向（nontargeting,NT）的对照细胞（NT）细胞,利用Western blot技术,检测SETD2唯一催化的组蛋白H3K36me3表达水平。3.检测SETD2-KO后A549细胞基因组稳定性利用DNA微阵列在全基因组水平计算杂合性缺失,端粒等位基因失衡和大片段迁移事件发生的数量,观察同源重组缺陷事件的数目,以评估SETD2-KO后A549的基因组稳定性。4.探索SETD2-KO后A549细胞基本表型变化利用CCK-8检测和竞争培养实验,观察SETD2-KO后A549细胞增殖能力的变化;应用Annexin V-FITC/PI对细胞进行双重染染色,以检测SETD2-KO的A549细胞凋亡状况;通过PI染色,以检测SETD2-KO的A549细胞的细胞周期变化。5.筛选SETD2-KO的下游分子、通路及说明其机制通过RNA-seq和蛋白质谱检测分析,筛选差异基因及蛋白、富集的功能通路及功能聚类。通过ATAC-seq说明其相互作用机制。6.验证SETD2-KO后A549细胞下游分子的变化对SETD2-KO后导致的差异表达基因,通过RT-q PCR和免疫荧光分别验证其在m RNA水平和蛋白水平的变化。7.检测在A549细胞中,SETD2-KO后下游分子介导的细胞粘附能力通过用无血清培养基培养细胞4天后计算细胞集落数目。使用细胞粘附能力检测试剂盒检测粘附于基质的细胞数目以评估细胞的粘附能力。8.探索SETD2-KO的A549细胞在小鼠体内转移能力使用带有荧光素酶报告基因的NT,sg4,sg5细胞接种于4-5周龄NOD-SCID小鼠皮下,对小鼠进行活体成像观察肿瘤细胞转移情况。9.分析SETD2-KO介导的下游分子与NSCLC患者预后的关系通过对TCGA数据进行分析,探求SETD2-KO介导的下游分子和NSCLC患者临床预后的关系。结果1.145例NSCLC患者靶向DNA测序结果显示肺癌中SETD2突变频率达8%,同时在3p拷贝数变异的比例达34%,SETD2突变的患者TMB比无突变的患者高;对TCGA数据分析显示SETD2突变的NSCLC患者TMB比无突变的患者高,同时低表达SETD2的NSCLC患者预后更差。2.SETD2唯一催化的H3K36me3蛋白在SETD2-KO的细胞（sg3、sg4、sg5）较NT细胞表达明显降低,而H3K36me1、H3K36me2表达无差异,构建SETD2敲除模型成功。3.SETD2-KO和SETD2-WT的A549细胞,同源重组修复缺陷评分分别为177和164,SETD2敲除后基因组不稳定。4.在SETD2-KO后的A549细胞中,细胞增殖能力降低,晚期凋亡的细胞比例增多,处于S期的细胞比例减少。5.对SETD2-KO后A549细胞差异表达的基因进行GSEA分析,富集在上皮间质转换（epithelial–mesenchymal transition,EMT）、血管生成和凋亡相关的通路中;在蛋白层面,差异表达蛋白聚类主要与细胞粘附、迁移、运动有关,蛋白结构域聚类于EGF-样结构域、CUB结构域和延长因子Tu结构域、延长因子Tu GTP结合结构域。功能富集、功能聚类以及结构域富集均与SETD2敲除后的下游分子VCAN有关;ATAC-seq显示SETD2缺失后通过与VCAN的开放区域发生相互作用而调节其积极转录,导致VCAN表达上调。6.在SETD2-KO的A549细胞中,VCAN在m RNA水平升高;在蛋白水平,Versican表达水平升高,同时定位在细胞膜边界和细胞质中。7.在SETD2-KO的A549细胞中,对富集到的细胞粘附能力进行检测,显示细胞粘附能力降低。8.接种有SETD2-KO的A549细胞（sg4组和sg5组）的小鼠荷瘤部位活体成像时显影消失更快,其在小鼠体内转移能力增强。9.对TCGA数据分析显示,SETD2的下游分子VCAN高表达的NSCLC患者预后更差。结论SETD2通过调控VCAN的表达参与细胞粘附及移动,在非小细胞肺癌中发挥抑癌基因的功能。