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背景:创伤性颅脑损伤（Traumatic Brain Injury,TBI）严重危害人类生命安全和社会生产力。TBI后继发性神经损伤和神经-血管单元的保护一直是神经科学研究的热点问题。研究发现TBI后神经系统细胞间的相互作用和继发性神经免疫-炎症反应是导致继发性神经功能损伤的主要原因。本课题通过活体（TBI小鼠模型）和离体（CCE细胞模型）外伤模型,使用慢病毒及AAV基因编辑技术,采用全基因转录组测序（RNA seq）、实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR,RT-q PCR）、透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）、纳米颗粒跟踪分析技术（Nanoparticle Tracking Analysis,NTA）、蛋白免疫共沉淀（Immunoprecipitation,IP）、酶联免疫吸附实验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）、蛋白免疫印迹实验（western blot）、免疫荧光染色（immunofluorescence,IF）、苏木精-伊红染色法（hematoxylineosin staining,HE）及流式细胞技术（flow cytometry,FCM）等分子生物学技术和水迷宫（Morris Water Maze,MWM）、转轴实验（Rotarod test）及改良神经行为学评分（modified Neurological Severity Score,m NSS）等功能学实验,并使用9.4T高场强核磁共振（magnetic resonance imaging,MRI）影像学,对TBI后星形胶质细胞外泌体lnc RNA对小胶质细胞功能调控作用和继发性神经炎症反应的影响展开了深入研究。主要包括以下四个部分:⑴.外泌体lnc RNA 49RIK抑制TBI后神经炎症损伤的机制研究;⑵.TBI后miRNA-10a-5p/SMAD7调控小胶质细胞表型转化的机制研究;⑶.SMAD7调控小胶质细胞功能抑制TBI后神经血管单元损伤作用的机制研究;⑷.SMAD7/IκB-α通过抑制NF-κB激活保护神经功能的机制研究。通过上述研究揭示了星形胶质细胞外泌体通过lnc RNA4933431K23RIK（lnc RNA 49RIK）调控小胶质细胞miRNA-10a-5p/SMAD7/IκB-α信号通路对TBI后小胶质细胞功能的效应,阐释其下游信号的具体分子机制,探索以SMAD7为靶点改善TBI后神经炎症的可行性,为TBI治疗提供有效的新途径。第一部分:外泌体lnc RNA 49RIK抑制TBI后神经炎症损伤的机制研究目的:探索TBI后星形胶质细胞外泌体对神经血管单元及功能的保护作用。方法:建立TBI小鼠模型及CCE细胞模型;使用超速离心法提取外泌体并采用透射电镜和蛋白免疫印迹及纳米颗粒跟踪分析技术进行鉴定;RNA seq技术检测星形胶质细胞和外泌体非编码RNA（non-coding RNA,nc RNA）表达;HE染色观察TBI后脑挫裂伤灶情况;IF观察神经血管单元变化;ELISA检测小胶质细胞炎症因子表达情况;细胞吞噬实验观察小胶质细胞对外泌体的吞噬作用;MWM及转轴实验观察TBI小鼠模型的神经及运动功能。结果:成功建立TBI小鼠及CCE细胞模型;成功提取外泌体并能够被小胶质细胞吞噬;筛选出具有明显差异lnc RNA 49RIK;lnc RNA 49RIK能够抑制小胶质细胞促炎因子表达,减小脑挫裂伤灶的体积,促进神经血管单元重建;lnc RNA 49RIK能够改善TBI小鼠神经及运动功能。结论:TBI后星形胶质细胞外泌体lnc RNA 49RIK通过调控小胶质细胞的功能发挥神经保护作用。第二部分:TBI后miRNA-10a-5p/SMAD7调控小胶质细胞表型转化的机制研究目的:研究星形胶质细胞外泌体分泌lnc RNA 49RIK通过miRNA-10a-5p/SMAD7信号通路调控TBI后小胶质细胞表型转化的机制。方法:使用RNA seq技术检测星形胶质细胞外泌体nc RNA和小胶质细胞miRNA表达并结合数据库和文献分析其靶基因位点;RT-q PCR检测nc RNA表达和炎症因子及下游靶基因m RNA表达;蛋白免疫印迹实验检测下游靶点分子蛋白表达水平;IF观察小胶质细胞标记蛋白及靶标蛋白表达变化;ELISA检测小胶质细胞炎症因子表达情况;双荧光素酶报告基因实验验证非编码RNA（no coding RNA,nc RNA）之间及与靶标蛋白之间的结合关系,双荧光素酶片段缺失实验检测E2F7和TFAP2C调控SMAD7位点;MWM及转轴实验观察TBI小鼠的神经功能及运动功能。结果:初步筛选出lnc RNA 49RIK调控的miRNA-10a-5p和其靶标蛋白转录因子E2F7和TFAP2C及SMAD7;结果发现lnc RNA 49RIK可以抑制miRNA-10a-5p表达,促进E2F7和TFAP2C转录因子活性,进而上调SMAD7表达水平;SMAD7可以改善TBI小鼠的神经及运动功能。结论:星形胶质细胞外泌体分泌lnc RNA 49RIK通过miRNA-10a-5p/SMAD7调控TBI后小胶质细胞的表型转化。第三部分:SMAD7调控小胶质细胞功能抑制TBI后神经血管单元损伤作用的机制研究目的:研究SMAD7调控小胶质细胞功能抑制TBI后神经血管单元损伤的作用机制。方法:通过HE染色及MRI影像学评估TBI后脑挫裂伤灶情况;RT-q PCR及蛋白免疫印迹实验分别检测炎症因子m RNA及靶点分子表达;IF观察小胶质细胞和星形胶质细胞及神经髓鞘标记蛋白表达变化;ELISA检测小胶质细胞炎症因子表达水平;MWM及转轴实验观察TBI小鼠的神经及运动功能;Transwell实验及琼脂糖斑点实验检测小胶质细胞的迁徙能力及趋化能力;吞噬实验观察小胶质细胞吞噬能力。结果:激活SMAD7/IκB-α信号通路能够改善脑挫裂伤灶体积,抑制小胶质细胞炎症因子上调;SMAD7抑制小胶质细胞迁徙能力、趋化能力,增强小胶质细胞吞噬能力;SMAD7促进神经血管单元重建,即BBB的保护及神经元的再生,促进TBI小鼠的记忆及运动能力恢复。结论:SMAD7调节小胶质细胞表型转化及功能促进TBI后神经血管单元及神经功能的保护。第四部分:SMAD7/IκB-α通过抑制NF-κB激活保护神经功能的机制研究目的:探究SMAD7/IκB-α信号通路通过负向调控NF-κB p50/p65激活促进TBI后神经功能保护的机制研究。方法:采用蛋白免疫印迹实验检测小胶质细胞NF-κBp50/p65、IκB-α/p-IκB-α、SMAD7表达水平;IP检测IκB-α泛素化及IκB-α表达情况,IB检测SMAD7/IκB-α表达;此外分别通过FCM技术、IF技术、MWM及转轴实验观察SMAD7激动剂积雪草苷（Asiaticoside,ATS）对小胶质细胞表型转化,BBB保护及TBI后小鼠的神经功能作用。结果:LPS刺激小胶质细胞后NF-κB p50/p65表达增高,过表达SMAD7质粒及激动剂积雪草苷逆转NF-κB p50/p65表达而促进IκB-α表达;SMAD7通过抑制IκB-α的泛素化降解减少NF-κB p50/p65激活入核;与TBI组相比,积雪草苷治疗组SMAD7/IκB-α表达上调,小胶质细胞向抑炎型转化,BBB得以保护,TBI小鼠的神经功能得以改善。结论:SMAD7/IκB-α信号通路通过负向调控NF-κB p50/p65激活保护TBI后神经功能的作用。