【摘 要】
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青枯雷尔氏菌作为一种模式病原细菌,其致病机理复杂。三型分泌系统（TypeⅢsecretion system,T3SS）是其决定性致病因子,其分泌的效应蛋白在菌株的致病力和诱导植株的抗病性上均发挥着重要作用。当分泌到寄主细胞的效应蛋白被寄主识别时,会诱发寄主产生过敏性坏死反应（Hypersensitive response,HR）,激发寄主的防御反应。虽然青枯菌的三型分泌系统效应蛋白数量众多,但是关
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青枯雷尔氏菌作为一种模式病原细菌,其致病机理复杂。三型分泌系统（TypeⅢsecretion system,T3SS）是其决定性致病因子,其分泌的效应蛋白在菌株的致病力和诱导植株的抗病性上均发挥着重要作用。当分泌到寄主细胞的效应蛋白被寄主识别时,会诱发寄主产生过敏性坏死反应（Hypersensitive response,HR）,激发寄主的防御反应。虽然青枯菌的三型分泌系统效应蛋白数量众多,但是关于其与寄主植物抗性相关研究还比较少。烟草作为青枯菌的寄主之一,烟草青枯病在我国南方地区发生尤为严重,培育烟草抗性品种是防治烟草青枯病的一种重要手段,但是目前还未对我国已培育出的抗青枯病烟草品种进行系统评价,筛选有效的抗性品种。因此,收集我国已有的抗青枯病烟草并筛选其中抗性较强的烟草品种,以基因组信息完整的青枯菌株作为材料,利用瞬时表达体系在抗性烟草上进行无毒蛋白的筛选,有助于解析病原菌致病机理,为培育持久抗烟草青枯病的材料,防控烟草青枯病提供理论依据。本学位论文取得的主要研究结论如下:1.通过室内苗期人工接菌的方法,在全国18份抗青枯病烟草材料中筛选到对强致病力菌株CQPS-1具有较强抗性的烟草材料GDSY、G3和2015-614选取了全国不同地区培育的18份抗青枯病烟草材料,于烟草苗期在室内温室采用不伤根灌根接菌处理的方法,分别在10~7 cfu/m L和10~8 cfu/m L接菌浓度条件下评价烟草抗病性,结果表明接菌浓度提高,烟草对青枯菌的抗性降低;烟草品种GDSY在10~7 cfu/m L和10~8 cfu/m L接菌浓度下病情指数分别为3.33和6.25,对菌株CQPS-1表现为高抗;此外,品种G3和2015-614抗性也较为稳定,在两个接菌条件下病情指数均小于40,表现为抗病。2.利用农杆菌介导的瞬时表达系统筛选到三个在高抗材料GDSY叶片上产生坏死表型的效应蛋白Rip26、Rip28和Rip61从青枯菌CQPS-1中克隆了40个效应蛋白,并利用植物表达载体p GWB505构建成功39个效应蛋白基因的瞬时表达载体。利用农杆菌介导的瞬时表达系统将这39个蛋白表达于高抗烟草GDSY叶片中,结果发现,效应蛋白Rip28能在烟草叶片上诱发强烈的坏死反应,与阳性对照Rip AAGMI1000产生的表型基本一致,效应蛋白Rip26和Rip61在注射后9天于叶片上诱发轻微的黄化坏死;此外,效应蛋白Rip28能在其他抗性的烟草品种叶片诱发叶片组织的坏死,而效应蛋白Rip26和Rip61注射到其他抗性烟草叶片无表型。3.通过基因敲除技术解析了3个效应蛋白在青枯菌菌株生理生化功能及毒力特性中的作用,明确了其在GDSY对菌株CQPS-1的抗性中起着重要作用利用同源重组的方法敲除了野生型菌株CQPS-1的效应蛋白基因,获得了突变菌株?rip26、?rip28和?rip61,结果表明相较于野生型菌株,效应蛋白基因缺失对于菌株的菌落形态和正常生长没有影响,菌株生物膜形成能力增强,对氮源的代谢能力增强而碳源代谢能力相对减弱,且菌株?rip28和?rip61运动性下降。当菌株的效应蛋白基因rip26、rip28和rip61分别缺失后,抗性品种GDSY对菌株CQPS-1的抗性降低,不再表现为高抗,发病严重,病情指数达到62.5、70和80;突变菌株?rip26、?rip28在GDSY皿内无菌小苗和叶片中的增殖能力变强,突变菌株?rip26和?rip28在皿内无菌小苗中增殖量是野生型菌株的100倍,突变菌株?rip26和?rip28在叶片中增殖量分别是野生型菌株的30倍和15倍。4.生物信息学分析明确了效应蛋白Rip28的结构特性,并且构建了其原核表达载体Rip28-p GEX-6p-1,实现了蛋白Rip28的体外大量表达,室内盆栽条件下烟草叶片喷施蛋白减轻了青枯病的发生效应蛋白Rip28全长2799 bp,编码932个氨基酸,预测其理论分子量为101.64 k Da,等电点6.83,为亲水性蛋白,未发现跨膜结构域和N端的信号肽,Rip28存在两个预测的功能结构域,分别为98-477个氨基酸区间的FAD依赖的氧化还原酶结构域,一个614-914个氨基酸区间的蛋白酶结构域。构建了原核表达载体Rip28-p GEX-6p-1,实现了蛋白Rip28的体外大量表达;在室内盆栽条件下,接菌前间隔2 d连续两次叶片喷施蛋白能减轻烟草青枯病的发生,病情指数降低,以200μg/m L浓度处理效果最佳。
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