【摘 要】
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异体（异种）皮肤是严重皮肤创伤后的首选替代用品,但因免疫排斥问题,应用受到限制。如何使移植的异体皮肤能长期存活甚至永久覆盖创面,成为研究热点。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）易于采集、分离和体外扩增,除具有高度增殖及多向分化潜能、促进机体造血重建外,还具有抑制同种异体免疫反应、减轻移植排斥等免疫调节作用,已被用于皮肤病方面的临床研
【基金项目】
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苏州大学-泗洪县人民医院临床免疫协同创新中心； 国家自然科学基金（31370887;313402511）；
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异体（异种）皮肤是严重皮肤创伤后的首选替代用品,但因免疫排斥问题,应用受到限制。如何使移植的异体皮肤能长期存活甚至永久覆盖创面,成为研究热点。骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）易于采集、分离和体外扩增,除具有高度增殖及多向分化潜能、促进机体造血重建外,还具有抑制同种异体免疫反应、减轻移植排斥等免疫调节作用,已被用于皮肤病方面的临床研究中。骨髓间充质干细胞是一群多克隆的细胞群体,体外培养的间充质干细胞与它们的原始祖细胞存在较大差异,其表型特征和生物学功能之间的对应关系仍不清楚。CD45和CD31作为骨髓中非造血谱系标记,可用于鉴定间质细胞特征,但是分选后的细胞亚群是否在免疫调节中具有优势作用仍需要进一步研究。研究目的:本文通过CD45和CD31免疫磁珠分选骨髓间充质干细胞获得四个亚群细胞,通过小鼠皮肤移植模型和细胞共培养体系,明确CD45-/CD31-BMSCs是一群免疫调节特异性细胞亚群。研究方法:1.取健康C57BL/6雄性小鼠,收集骨髓细胞贴壁培养,经传代1次后,经磁珠 CD45、CD31 分选,获得 CD45-/CD31-BMSCs、CD45-/CD31+BMSCs、CD45+/CD31+BMSCs及CD45+/CD31-BMSCs四群细胞;2.建立小鼠同种皮肤移植模型,将未分选细胞及四种分选亚群细胞通过直接皮下注射,观察移植皮片变化,分析各细胞亚群在皮肤移植排斥中的作用;3.DiI染色各组细胞后,通过皮下直接注射或者尾静脉注射,观察各组细胞在体内脏器驻留以及迁移情况;4.建立BMSCs/DC/T的细胞共培养系统,检测Tregs细胞比例,上清IL-10、IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ的表达;5.依据四群细胞进行mRNA芯片数据分析,通过qPCR鉴定CD45+CD31+BMSCs、CD45-CD31-BMSCs、CD45-CD31+BMSCs、CD45+CD31-BMSCs四群细胞差异表达基因。研究结果:1.骨髓细胞经过贴壁培养,传1代后呈现间充质细胞表型及分化能力;2.未分选的 BMSCs 表面分子:CD45（3.3%）、C31（7.4%）;CD45-/CD31-BMSCs表面分子:CD45（2.6%）、CD31（2.4%）,其他表面分子与未分选BMSCs 比较接近;CD45-/CD31+BMSCs:CD45（3.2%）、CD31（15%）、MHC-Ⅱ（16.2%）、CD45RA（21.5%）;CD45+/CD31-BMSCs:CD45（24%）、CD31（4.9%）;CD45+/CD31+细胞:CD45（38%）、CD31（47.7%）;3.依据 The Kaplan-Meier 生存曲线显示,CD45-CD31-BMSCs 组明显提高同种异基因移植皮片的生存期;HE染色可见,注射细胞组的移植皮片保存了大部分皮肤附属物和松散的结缔组织,其中CD45-CD31-BMSCs组移植皮肤结构最为完整;4.DiI染色细胞组经皮下注射体内,在小动物活体成像系统下观察,结果显示CD45-CD31-BMSCs组在小鼠移植皮片中聚集最多,分别取小鼠各脏器,包括心、肺、肝、脾脏、肾脏,可见只有肝脏和脾脏显示有红色标记细胞,CD45-CD31-BMSCs迁移至肝脏和脾脏处最多;5.为了观察各亚群组细胞在体内的迁移情况,将细胞经尾静脉注射体内,在小动物活体成像系统下观察各组细胞分布。结果显示,CD45-CD31-BMSCs细胞组在小鼠移植皮片附近聚集最多,可见该组细胞的迁移能力最强;6.CD45-CD31-BMSCs组诱导Treg百分比例明显增加。IL-2、IL-4和IL-6在各组中的表达差异不明显,在CD45-CD31-BMSCs组、CD45+/CD31-BMSCs组和CD45-/CD31+BMSCs组中IL-10的表达明显下降。7.差异基因筛选中发现,CD45-CD31-BMSCs组细胞中Spon2基因表达明显降低,Sema7a基因表达显著增加。结论:1.经过CD45和CD31免疫磁珠分选的四组亚群细胞,在细胞表型和基因表达方面都存在显著差异;2.相比未分选的BMSCs,经磁珠分选的CD45-/CD31-BMSCs可显著促进移植皮肤存活;3.CD45-/CD31-BMSCs通过增加迁移率、促进Treg产生,增强细胞的免疫调节作用,其分子机制与Spon2和Sema7a密切相关。
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