【摘 要】
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目的:本研究旨在探索PHF14,一种新鉴定的转录调控蛋白,在低氧诱导因子（HIF）-1α调控表达后,对缺氧环境下肾小管上皮细胞糖代谢转换调控与缺血再灌注（IRI）诱导急性肾损伤（AKI）后肾脏修复的影响,并探讨其相关机制。方法:1.利用8至12周龄的雄性野生型C57BL/6小鼠通过双侧肾蒂夹闭25min构建IRI诱导AKI小鼠模型及对照假手术小鼠模型,于造模后相应时间点处死小鼠,留取血清样本检测血
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目的:本研究旨在探索PHF14,一种新鉴定的转录调控蛋白,在低氧诱导因子（HIF）-1α调控表达后,对缺氧环境下肾小管上皮细胞糖代谢转换调控与缺血再灌注（IRI）诱导急性肾损伤（AKI）后肾脏修复的影响,并探讨其相关机制。方法:1.利用8至12周龄的雄性野生型C57BL/6小鼠通过双侧肾蒂夹闭25min构建IRI诱导AKI小鼠模型及对照假手术小鼠模型,于造模后相应时间点处死小鼠,留取血清样本检测血清尿素氮,获取肾脏组织进行切片HE染色,利用Western blot检测HIF-1α、PHF14、PKM2在IRI诱导AKI进程中的表达变化。2.构建他莫昔芬条件诱导PHF14敲除的小鼠与对照小鼠（敲除小鼠基因型:PHF14 flox/flox Cre+;对照小鼠相应的基因型为:PHF14 flox/flox Cre-,选取8至12周龄雄性的小鼠使其接受连续5天的他莫昔芬腹腔注射进行条件诱导敲除PHF14,经实验确认小鼠PHF14基因是否敲除）,后通过双侧肾蒂夹闭25min构建IRI诱导AKI小鼠模型及对照假手术小鼠模型,于造模后24h处死小鼠,留取血清样本检测尿素氮、NGAL,获取肾脏组织以测定乳酸,HE染色及免疫荧光检测PHF14、M2型丙酮酸激酶（PKM2）、c-Myc表达,利用Western blot、Real-time PCR分别检测HIF-1α、PHF14、c-Myc、PKM2表达。另外于造模后28天处死小鼠,获取肾脏组织后对肾脏的组织切片做Masson染色并利用Western blot对肾脏的PHF14、α-SMA以及Fn在蛋白表达水平进行检测。3.利用NCBI-GEO数据库在线获取沉默PHF14后的细胞系基因表达谱,并进行相关基因的差异表达分析,探究PHF14对糖酵解相关关键酶及促进糖酵解的相关酶的表达水平的影响,并分析表达下调的基因及其可能的相关调控机制。利用Crisprcas9系统构建的PHF14敲除NRK-52E细胞及对照Cas9细胞,利用缺氧培养袋进行缺氧处理24h后,观察细胞形态学变化并留取培养液上清以测定糖酵解产物（乳酸）,利用Western blot检测HIF-1α、PHF14、c-Myc、PKM2表达。结果:1.小鼠双侧肾脏夹闭25min后AKI进程中HIF-1α、PHF14、PKM2的表达呈时间依赖性,病程中小鼠血清尿素氮浓度呈先增后减变化特征,于再灌注24小时后达峰,造模组小鼠相较于假手术小鼠肾组织损害明显。2.双侧肾脏缺血25min再灌注24h后,造模小鼠相较于假手术小鼠血清尿素氮、血清NGAL及肾脏组织乳酸测定值均显著升高,PHF14敲除小鼠相较于对照小鼠肾损伤程度及血清尿素氮、血清NGAL升高水平更显著,其PKM2、c-Myc表达及肾脏组织乳酸含量相较于对照小鼠明显下降。双侧肾脏缺血25min再灌注28天后,PHF14敲除小鼠相较于对照小鼠肾脏组织纤维化程度增高,Fn、α-SMA表达水平显著升高。3.沉默PHF14的细胞系基因表达谱差异表达基因分析发现糖酵解关键酶（PKM2等）、抑制氧化磷酸化促进糖酵解的丙酮酸脱氢酶激酶（PDK）,c-Myc的表达下调,差异表达基因进行KEGG信号通路富集,发现表达下调的基因富集到了Wnt信号通路。缺氧处理24h后PHF14敲除NRK-52E细胞PHF14、c-Myc、PKM2表达水平及其培养液上清乳酸测定水平相较于对照Cas9细胞显著下降。结论:体内、外实验证明PHF14可以上调缺氧条件下肾小管上皮细胞的糖酵解水平,促进肾小管修复。肾组织缺血缺氧,增加肾小管上皮细胞HIF-1α的表达,诱导PHF14表达增加,表达上调的PHF14进一步调节c-Myc的表达,促进PKM2的表达进而提高糖酵解水平,改善细胞能量供应,促进肾小管上皮细胞修复,减少AKI慢性转化率。
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