【研究背景】在我国膀胱尿路上皮癌是常见的泌尿系统疾病,据统计,5%-10%的膀胱癌患者是在转移期间诊断出来的,并且在膀胱根治切除术后,50%病人会出现局部或者远期肿瘤复发,虽然针对膀胱癌整体治疗方法及手术技术取得了很大的发展与进步,但是将近50%-70%的新诊断膀胱癌5年内都会面临复发的风险。因此,需要寻找与膀胱癌进展转移相关的新型分子标志物,预测哪些病人更容易进展为肌层浸润性膀胱癌,从而为分子靶向治疗寻找发展方向。KIF4A（kinesin family member 4A）是驱动蛋白超家族（KIFs）的一员,到目前为止,越来越多的研究证实驱动蛋白超家族（KIFs）在多种人类癌症中起着重要的作用,其中也包括膀胱癌;驱动蛋白参与细胞的分裂,蛋白的异常可以通过染色体过度凝集、纺锤体形成异常、细胞分裂缺陷、形成后期桥或非整倍体及有丝分裂阻滞,改变细胞内遗传物质的分布,使细胞周期失控,最终渐进性地导致肿瘤发生;另外,驱动蛋白在转运细胞器,m RNA复合物以及调节质膜受体发挥着重要的作用;近年来已有多项研究证实其在肿瘤中的致癌作用,但在膀胱癌中的具体作用尚未深入研究,其功能机制需进一步阐明。【研究目的】探索KIF4A在膀胱尿路上皮癌与正常邻近尿路上皮表达高低情况并进行验证;研究KIF4A表达与膀胱癌患者预后以及临床病理分期关系,进一步明确KIF4A在膀胱上皮癌的发生、发展、迁移及侵袭中的作用及其作用机制。【研究方法】1.对10对膀胱尿路上皮癌及癌旁组织进行转录组测序,根据转录组测序结果、数据库及相关文献研究,确定KIF4A在膀胱尿路上皮癌的表达情况。2.研究KIF4A蛋白在膀胱尿路上皮癌细胞系中表达情况,提取病人膀胱尿路上皮癌组织中的蛋白及m RNA研究KIF4A的表达水平。3.通过对我院收集的232例膀胱癌病人组织芯片进行免疫组化染色,进一步确定KIF4A在膀胱癌患者表达情况,根据表达量将病人分为高表达和低表达组,以此分析KIF4A表达与患者临床病理特征及预后的关系。4.用慢病毒及si RNA构建过表达、稳定敲减以及瞬时沉默细胞系,稳定干扰细胞系用于二代转录组测序,进行下一步通路变化分析;通过细胞集落形成及CCK-8试验研究KIF4A对膀胱癌细胞增殖的影响,通过Transwell小室侵袭试验以及细胞划痕试验研究KIF4A在膀胱癌细胞侵袭和迁移能力的影响,利用流式细胞技术研究KIF4A在膀胱癌调亡中的作用,通过Westernblot进一步探索在KIF4A敲减和过表达细胞系中增殖、侵袭、迁移、凋亡相关蛋白变化。5.通过生物信息学分析、免疫荧光染色、免疫共沉淀及核质分离实验分析,探索KIF4A表达与转录辅助因子YAP1以及ITGB1/PI3K/Akt通路的关系。【研究结果】1.10对组织转录组测序结果提示与癌旁组织相比,KIF4A在膀胱尿路上皮癌中显著高表达（P＜0,01）;实时定量荧光PCR（RT-q PCR）及蛋白免疫印迹（WB）表明,KIF4A在膀胱癌患者中的表达量明显高于癌旁正常上皮组织。2.232例膀胱尿路上皮癌免疫组化结果表明KIF4A的表达量在MIBC中显著高于NMIBC,组织免疫组化加权评分按公式确定:0×%不染色+1×%弱染色+2×%中等染色+3×%强染色;评分在0~300之间,将细胞核的癌特异性染色评分与细胞质的癌特异性染色评分分开计算后合并,根据中位数将总分分为高或低（≤240,低表达;＞240,高表达）,发现高表达KIF4A与不良临床病理分期分级、较大肿瘤体积及较差OS、CSS预后指标密切相关（p＜0.05）。3.对Sv-huc及BIU-87、5637、J82、UM-UC-3、HT1376、T24细胞蛋白质检测,发现MIBC细胞系（5637,J82,T24,UM-UC-3）及NMIBC细胞系（BIU-87）表达量高于正常尿路上皮细胞系（Sv-huc）4.使用小干扰RNA沉默5637细胞系及T24细胞系中KIF4A表达,构建KIF4A过表达5637细胞系,集落形成和CCK-8细胞增殖试验显示与对照组相比,敲减的T24和5637细胞增殖能力明显下降（p＜0.001）;划痕实验显示,与对照组相比,KIF4A敲减的5637及T24细胞系的迁移能力明显下降（p＜0.001）;Transwell小室侵袭试验结果显示,KIF4A敲减的5637及T24细胞系侵袭能力明显下降（p＜0.001）;相反,KIF4A过表达的5637细胞系在集落形成试验中显示细胞增殖能力明显增加（p＜0.001）,迁移和侵袭能力明显增加（p＜0.001）,KIF4A表达与细胞EMT相关。流式细胞术检测结果显示敲减KIF4A促进膀胱癌细胞的凋亡。5.构建KIF4A敲减细胞系,行二代转录组测序,确定富集的下游通路,发现KIF4A与AKT通路相关,并通过影响ITGB1及ITGB3表达来影响下游AKT及YAP通路的激活;6.通过构建YAP过表达5637细胞系发现YAP1可促进KIF4A的转录表达,敲减TEAD1的5637细胞系中KIF4A m RNA及蛋白水平下降,表明YAP1和TEAD1可能在KIF4A的转录表达发挥着重要的作用。7.在敲减的KIF4A T24及5637细胞系中,WB发现与对照组相比YAP1蛋白水平下降,而过表达KIF4A 5637细胞系中,磷酸化的YAP明显下降,而YAP1蛋白未明显下降,进一步行核质分离及WB实验发现,KIF4A敲减后,与对照组相比,胞核胞质YAP1水平均下降,p-YAP（Ser127）水平在核内升高,KIF4A过表达后,YAP1水平在核内明显上调,p-YAP（Ser127）水平在核内明显下调,而二者在胞质变化不明显,另外,免疫荧光实验显示,与对照组相比,KIF4A敲减后YAP1在核内核外表达明显减弱,由此可以推测KIF4A在核内抑制YAP1磷酸化和降解发挥着重要的作用,表明KIF4A对于YAP1的稳定起着重要的作用。【结论】KIF4A在膀胱癌尿路上皮肿瘤中表达明显增高,其表达水平的高低可作为膀胱癌分期分级的可能分子标志物;KIF4A高表达是膀胱癌尿路上皮癌预后的危险因素;减少KIF4A的表达可以抑制膀胱尿路上皮癌细胞迁移、侵袭及上皮间质转化（EMT）能力;在膀胱尿路上皮细胞系中,KIF4A高表达导致ITGB1上调,激活AKT通路,并且维持YAP1的稳定性,成为导致膀胱癌侵袭进展的可能潜在机制。