论文部分内容阅读
研究背景黑色丘疹性皮病（Dermatosis Papulosa Nigra,DPN）是菲茨帕特里克（Fitzpatrick scale）IV–VI型中常见的一种良性皮肤病,典型临床皮损表现为面部多发性的黑色或棕黑色类圆形扁平丘疹,皮丘之间互不融合,直径约1～5mm,表面光滑[1,2,3]。临床上容易误诊,常误诊为脂溢性角化病、扁平疣、汗管瘤、软纤维瘤、光泽苔藓等疾病[3,4]。目前该疾病的发病机制尚不清楚。临床上对该病的治疗手段也相对比较单一,局限在液氮冷冻、二氧化碳激光及手术等有创手段,并且也有感染、色素沉着、疤痕等明显副作用[4,5]。随着人们对美好生活及面部美学的追求逐渐提升,该疾病带来的美学上的毁容往往给患者造成巨大的心理负担和家庭压力,理解其发生发展机制将有助于对DPN进行全程管理与医疗实践。近年来,全外显子组测序（whole exome sequencing,WES）技术在临床上得到广泛应用,为广大临床医生对肿瘤性疾病及非肿瘤性疾病的诊断和治疗提供了重要的参考价值[6,7,8]。全外显子测序大约包含了2万多个基因,利用液相杂交捕获技术或多重PCR扩增技术对基因组中的外显子区域进行富集,然后再通过高通量测序技术（next generation sequencing,NGS）对富集的序列进行基因位点检测。WES技术可以非常广泛覆盖范围内约98%以上点突变,以及绝大多数的拷贝数变异,为寻找疾病的相关致病突变基因提供了一种全新的检测方法[8,9]。目前尚未明确与DPN发病相关的致病基因,进而需要进一步的相关研究,来深入全面的了解DPN的发病分子机制。研究目的收集DPN病例临床的资料,详细地阐述DPN临床皮损、皮肤镜下及皮损组织病理切片的特征。提高对DPN疾病的认识,降低临床上DPN的误诊率及漏诊率。通过进行WES及生物信息学分析,在分子基因层面深入了解该病的发病机制,寻找特定的潜在的DPN的致病基因,为后续找到潜在有效的治疗靶点,从根本上抑制该病的发生,提供分子理论依据。此外,发现影响蛋白结构功能变异相关的生殖细胞突变和体细胞突变,也可为后续研究DPN的发病机制以及遗传学机制,提供分子生物学遗传理论基础。研究方法1.门诊收集DPN患者相关的临床信息,皮损表现、皮肤镜下表现及皮肤组织病理特征等。并做记录,统计汇总相关的结果。2.抽取10例DPN患者皮肤病损组织和外周血的DNA,进行WES上机测序,通过GATK、Annovar、Poly-Phen2、LRT、Mutation Taster和SIFT等生物信息学软件进行数据分析,包含测序数据质控,比对参考基因组,变异位点检测,体细胞突变和生殖细胞突变识别,注释突变位点,再根据Clin VAR、gnoma AD、OMMIN等疾病基因变异相关数据库过滤,最终筛选出DPN上全外显子区域的体细胞潜在的致病基因突变位点。3.针对潜在的致病基因突变位点,利用生物信息学分析预测该位点对蛋白结构、功能及蛋白所在的信号通路的影响。结果1.收集10例确诊为DPN的患者,患者皮肤肉眼及皮肤镜、组织病理切片都具有相对典型的特征。2.皮损组织及外周血组织测序的深度分别约为182X和191X,所有样本覆盖度均在99%。所有样本的Q30质量分数＞85%,Q20质量分数＞95%。测序总reads数据均在20G以上。所有样本的测序质量均符合后续数据分析要求。3.我们最终筛选出HRAS、CDC27、PHTF1、FGFR3、RBM12、CNTNAP5、HNMT、PHF5A、UBE2H、PTMA、DDX3X、CHIC1、PTEN和PUF60等14个候选致病基因突变位点。结合相关文献,最后确定HRAS基因chr11:534285 C＞A可能为DPN的潜在致病基因突变点。通过Mutation Taster软件预测突变对蛋白功能的影响,结果显示该突变导致氨基酸改变,是一种致病性突变。4.富集分析得出10条p＜0.05的信号通路,其中体细胞突变富集分析结果显示MAPk和EGFR通路存在异常,并且HRAS与MAPk和EGFR信号通路密切相关。这也侧面提示HRAS可能是DPN的致病基因。结论1)本研究通过临床收集病例资料,详细阐述了DPN皮损表现分布、皮肤镜下以及组织病理切片特征性表现。有助于减少临床上的误诊率及漏诊率,对DPN全面深度详细的了解,提高DPN的诊断率,选择合适的时机进行干预处理。2)本文首次报道了亚洲人群DPN患者的体细胞基因突变图谱,揭示该疾病新的基因突变信息。3)通过筛选发现HRAS、CDC27、PHTF1、FGFR3、RBM12、CNTNAP5、HNMT、PHF5A、UBE2H、PTMA、DDX3X、CHIC1、PTEN和PUF60等14个候选DPN致病基因。最终确定HRAS基因上1个新的非同义突变,HRAS可能是DPN的潜在致病基因突变。4)本研究通过生物信息学分析,发现DPN患者存在EGFR等信号通路存在异常。这也侧面提示HRAS可能参与DPN的发生与发展。