【摘 要】
：
目的:本课题采用基因重组技术将Avi-tag标签设计进HCV-Ag（Hepatitis c virus-antigen,HCV-Ag）,使得 HCV-Ag 能在体外被 BirA 酶催化成生物素化 HCV-Ag。以生物素化HCV-Ag为主要原料,建立基于磁珠、吖啶酯等的HCV快速检测试剂盒。新检测试剂盒在性能上须完全符合国家标准,检测时间能缩短至15 min以内,以期拓展现有免疫检测的适用范围。方法
论文部分内容阅读
目的:本课题采用基因重组技术将Avi-tag标签设计进HCV-Ag（Hepatitis c virus-antigen,HCV-Ag）,使得 HCV-Ag 能在体外被 BirA 酶催化成生物素化 HCV-Ag。以生物素化HCV-Ag为主要原料,建立基于磁珠、吖啶酯等的HCV快速检测试剂盒。新检测试剂盒在性能上须完全符合国家标准,检测时间能缩短至15 min以内,以期拓展现有免疫检测的适用范围。方法:第一部分:从蛋白质数据库中检索选取在中国广泛流行的丙型肝炎病毒亚型的蛋白质序列,并在其中加入15个氨基酸的Avi-tag标签序列,使得重组抗原具备在体外被生物素化的特点。将蛋白质序列转化为DNA序列,并制备含目的DNA序列的pET28a+质粒。将含目的基因序列的质粒转入大肠杆菌,采用含卡那霉素的培养平皿筛选阳性菌株,通过SDS-PAGE电泳以及Western方法对融合蛋白菌株的表达蛋白进行分析和鉴定,以获得表达HCV-Ag的工程菌。对HCV-Ag工程菌扩大培养的表达纯化过程进行优化,包括异丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导的浓度/时间,Ni柱纯化的咪唑洗脱浓度等已获得高产量、高活性的目的蛋白。在体外借助BirA酶将目的蛋白生物素化,得到生物素化HCV-Ag。最后将BirA酶法获得的生物素化HCV-Ag与化学法生物素化HCV-Ag进行的比对,评估该方法获得生物素化HCV-Ag的优劣。第二部分:将生物素化的HCV-Ag包被于磁珠表面,用以检测人血清中的HCV抗体,加入吖啶酯标记的兔抗人抗体作为二抗,经过反应洗涤后加入碱性的预激发液和激发液促进吖啶酯发出光粒子,通过特定设备接收光粒子的强度,根据检测值计算出血清中HCV抗体的浓度,以此建立HCV抗体检测试剂盒。首先通过信噪比法筛选出最佳的磁珠快速检测法的反应时间,然后采用HCV检测试剂盒的行业方法分别对试剂盒的灵敏度、重现性、稳定性等进行评估。为进一步确认试剂盒的准确性与灵敏度,分别采用国家血清盘以及162份临床血清样本对研发的试剂盒进行符合性及相关性比对。结果:成功获得HCV-Ag工程菌,得出工程菌扩大培养的最佳IPTG诱导参数为1 mM/L浓度/4 h培养,得出Ni柱纯化的最佳的咪唑洗脱浓度为200 mM/L。在体外借助BirA酶成功将HCV-Ag生物素化,酶法获得的生物素化HCV-Ag能显著降低磁珠快速检测法的本底值。成功构建含生物素化HCV-Ag、磁珠、吖啶酯等的HCV快速检测试剂盒,实现HCV抗体检测时间缩短至15 min以内。HCV快速检测试剂盒在灵敏度、准确性等方面符合国家血清盘的检测标准,并在与时间分辨免疫法的162份血样对比测试中一致性Kappa值为0.949显示非常高的一致性。结论:自制生物素化HCV-Ag达到抗原设计的具体要求,以HCV-Ag为主要原料制备的磁珠快速检测试剂盒完全符合国家质量标准,可以用于临床HCV抗体的快速鉴别。
其他文献
[目的]探讨基于血氧水平依赖磁共振成像（blood oxygen level dependent magnetic resonance imaging,BOLD-MRI）的影像组学鉴别肾脏良恶性肿瘤的价值。[材料与方法]回顾性分析我院2011年4月至2019年7月经病理证实并于术前2周内行肾脏常规MRI扫描及BOLD-MRI扫描的141例肾肿瘤患者资料。其中,男74例,女67例;恶性肿瘤118例,
＜正＞推荐语:面对新发展阶段企业内审工作的新要求,陕西移动对新一期综合审计服务采购项目进行了深入分析,针对数智化前瞻性审计无采购先例、基准价过低无法吸引优质供应商投标以及如何根据项目类别实现供应商差异化考评等三大难点,通过合理划分标包,增加数智化前瞻性标包实现综合审计产品的集中采购;通过结合市场调研和预算资金情况设置合理的资格条件,确保项目的充分竞争;通过优化基准价,紧贴需求特点创新研究评审办法兼
目的:通过比较不同严重程度颅脑创伤（TBI）患者同一时期血清中枢神经特异蛋白（s100β）水平的差异以及相同严重程度颅脑创伤患者不同时期s100表达水平的差异,探讨中枢神经特异蛋白（s100β）与颅脑创伤（TBI）严重程度的相关性及其与颅脑创伤患者病情发展、预后的关系。方法:选取2018年10月至2019年12月在我院（中国人民解放军联勤保障部队第904医院常州院区神经外科）经颅脑CT检查诊断为创
维生素A是人体必需的微量营养素之一,可以促进胚胎发育、生长、细胞分化,增强免疫力和维持视力,在医药、护肤品和食品等行业广泛应用。本文以解脂耶氏酵母菌株YL1为研究对象,以提高脂肪酶酶活从而提高维生素A棕榈酸酯的转化率为研究目的,通过常压室温等离子体诱变技术筛选得到一株高产脂肪酶突变株C4,结合响应面法优化发酵培养基,提高脂肪酶酶活并将其应用于维生素A棕榈酸酯的酶法合成研究,为工业化生产提供依据。主
目的探讨PDCA循环管理在某医院清洁手术围术期预防性使用抗菌药物的应用效果及其影响因素。方法回顾性调查2018年1月至2020年4月入住于常熟市第一人民医院、行Ⅰ类切口手术患者的出院病历,分别以2019年1月、2020年1月为干预时间点,2018年1月1日至2018年12月31日出院的7169例患者为对照组（A组）,2019年1月1日至2019年12月31日出院的7114例患者为第一轮干预组（B组
乙型肝炎是临床常见病毒性肝炎，传染性较强，主要传播渠道是血液，具有病程长的特点，且容易反复发作。现阶段临床上对于慢性乙肝主要以疫苗接种预防为主，患病后采取抗病毒治疗，目前尚未有特效药物或者治疗手段。乙肝患者的治疗时间十分漫长，最少要接受6个月以上的抗病毒治疗，患者服药依从性较差，加之多数患者对乙肝缺少系统全面的认识，甚至存在一定程度上的误区。一些患者可能要承受亲人及朋友的疏远、社会的歧视，心理压力
目的慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是临床常见的呼吸系统慢性疾病,患者主要呈现为不完全可逆的气流受限症状。COPD0级患者则是肺功能基本正常,暂无气流受限的COPD高危患者。常规肺通气功能检测在COPD 0级患者的应用效果不佳,而脉冲振荡法（Impulse oscillometry,IOS）是一种新型的肺功能检测技术,在COP
目的:通过分析儿童和成人抗NMDA受体脑炎患者的临床症状、辅助检查、认知功能以及预后,比较儿童和成人抗NMDA受体脑炎的临床特点,加深对抗NMDA受体脑炎的认识。方法:随机选择2017年10月至2019年9月期间宜兴市人民医院和复旦大学附属华山医院神经内科收治的80例抗NMDA受体脑炎患者作为研究对象,上述患者均符合相应的入选标准以及排除标准。按照年龄将上述患者分为儿童组（年龄＜14岁）以及成人组
目的:对比分析压力性尿失禁（SUI）的盆底超声特点,并在临床与超声参数的基础上建立预测SUI的列线图（Nomogram）模型,为疾病的临床防治工作服务。方法:采用回顾性分析研究方案,收集2019年6月-2020年8月在常州市武进人民医院就医、并进行盆底功能检查的产后妇女115例,根据是否发生SUI分为SUI组56例和非SUI组59例。详细收集两组女性的基本人口学资料、妊娠与分娩及宫腔相关资料等临床
目的:基于经会阴MRI-TRUS认知融合引导下前列腺靶向穿刺结合系统穿刺组和经直肠MRI-TRUS认知融合引导下前列腺靶向穿刺结合系统穿刺组的对比。分析比较两种穿刺方法的穿刺阳性率及两种穿刺方法各自出现并发症的概率,以此为依据,对两种前列腺穿刺方法相应的诊断安全性和准确率进行对比,为临床工作的开展提供参考依据,保证能够选择合适的前列腺穿刺方式。方法:选取自2019年11月至2020年9月这一时间阶