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本文主要从以下几方面进行论述：
第一部分 ESR1/2可影响NSCLC中重要的膜受体信号通路
目的：基于TCGA NSCLC基因表达数据分析，探究ESR1/2对NSCLC基因表达谱的影响。
方法：从UCSC Xena在线数据库获取TCGANSCLC基因表达数据集，采用R软件包“limma”进行基因差异表达分析，评估ESR1/2表达水平高低对NSCLC肿瘤组织样本中其他基因的表达的影响；筛选出差异表达基因（differential expression genes， DEGs），将DEGs作为目标基因集，采用在线工具DAVID Functional Annotation Tool进行基因本体（Gene ontology，GO）功能和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路注释，初步探讨ESR1/2对NSCLC关键分子事件和信号通路的潜在影响。
结果：差异表达分析结果显示有1237个基因在不同ESR1水平下具有显著的表达差异（∣Log2FC∣＞1且p＜0.05）。GO功能和KEGG通路富集结果显示，High-ESR1组中769个表达上调的DEGs主要富集于信号转导、免疫和炎症响应、细胞粘附、受体结合和激活等项中。High-ESR1组中468个表达下调的DEGs主要富集于转录调控、氧化还原过程、钙离子结合、CYP450相关代谢等项中。对于ESR2，有102个DEGs被筛选出来，High-ESR2组中95个上调的DEGs主要富集于细胞粘附、肢体形态发生、上皮细胞分化、钙离子结合、结构分子活性和GABA能神经突触等项中。High-ESR2组中7个下调的 DEGs的富集分析无显著性结果。对于 GO功能的细胞组分，ESR1和ESR2组中的DEGs均主要富集于质膜和细胞外空间。此外，富集于上述GO和KEGG项中的 DEGs还参与许多膜受体信号传导通路，如生长因子信号通路、Wnt/GSK/β-Catenin通路和Notch通路。
结论：ESR1/2可能影响NSCLC中许多重要的分子事件和信号通路，尤其是膜相关的细胞通讯相关过程，包括受体激活、信号转导、细胞粘附、免疫反应等。更为关键的提示是ESR1/2可能通过调节重要的膜受体信号通路来影响NSCLC的发生发展。因此，在接下来的研究中，我们将验证 ERs对 EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路的调节作用及对NSCLC进展的影响。
第二部分 ERs调节膜受体信号网络促进NSCLC的发生发展
目的:探究 ERs对 NSCLC细胞行为的影响，以及 ERs对 EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路和由此构成的信号网络的调节作用。
方法：（1）不同浓度的17β-E2（0、10、20 nM）处理细胞72 h之后，CCK-8检测各NSCLC细胞株的增殖情况；Western Blot检测各细胞株中ERα和ERβ的表达情况。
（2）在PC9/G和H1299细胞中转染si-ERα/si-ERβ后，Western Blot检测沉默ERs对凋亡相关蛋白、迁移侵袭相关蛋白表达的影响；转染 si-ERα/si-ERβ或氟维司群（Fulvestrant，Ful）预处理后，吉非替尼（Gefitinib，Gef）或空白对照二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）孵育细胞48 h，流式细胞术检测沉默ERs对细胞凋亡比率的影响，Transwell检测ERs对细胞迁移侵袭能力的影响。
结果：1. ERs促进NSCLC细胞增殖、迁移侵袭和凋亡逃逸
（1）E2处理显著增强了PC9/G、PC9与H1299细胞的增殖能力（p＜0.05），但对A549、H1975与HCC827细胞的增殖没有影响；ERα与ERβ在PC9/G、PC9与H1299细胞中显著高表达，而在A549、H1975与HCC827细胞中的表达水平相对较低。
（2） si-ERα与si-ERβ分别沉默ERα和ERβ后，均可增加PC9/G和H1299细胞的凋亡（p＜0.05）；且与单用Gefitinib相比，si-ERs与Gefitinib联合可显著提高PC9/G和H1299细胞的凋亡率（p＜0.05）。si-ERα与si-ERβ均可下调PC9/G和H1299细胞中Survivin和Bcl-2的表达（p＜0.05），上调Cleaved Caspase3的表达（p＜0.05）。Bim的表达在PC9/G细胞中被si-ERs上调（p＜0.05），在H1299细胞中不受影响。
2. ERs调节EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路中关键节点蛋白的表达和活化
（1） si-ERs下调PC9/G和H1299细胞中Notch1、NICD、Hes1和β-Catenin的表达（p＜0.05）。si-ERs还下调H1299细胞中GSK3β的表达同时上调GSK3β的磷酸化（p＜0.05）。PC9/G细胞中GSK3β与pGSK3β的表达水平未受到si-ERs的影响。
（2）PC9/G细胞中，E2（10、20 nM）可上调ERα与ERβ的表达（p＜0.05）。E2也调节Notch1通路关键蛋白的表达。10或20 nME2可同时上调Notch1、NICD和Hes1的表达（p＜0.05）；而高浓度的E2（50 nM）上调Hes1表达（p＜0.05），下调Notch1的表达（p＜0.05），对NICD的表达没有明显影响。E2可以小幅度上调β-Catenin的表达（p＜0.05），但并不影响GSK3β的表达。
3.膜受体信号网络模型的构建和模拟仿真
（1）基于EGFR、Notch1和GSK3β/β-Catenin通路相关蛋白的经时表达数据构建了ERs、EGFR、Notch1和GSK3β/β-Catenin通路串话的常微分方程（Ordinary differential equations，ODEs）模型，得到的信号网络包括66个反应，43个节点和98个参数。当EGF，E2和Dll1均处于低水平（All low group）时，模型输出维持在低水平。
（2）模型预测显示，即使EGFR通路被抑制，ERs的过度活化也会重新激活EGFR，从而导致EGFR TKI耐药。实验证实Gefitinib和Fulvestrant联合作用于NSCLC细胞显示出更好的肿瘤抑制效果；对于Gefitinib耐药的PC9/G和H1299细胞，沉默ERs也可增强Gefitinib的促凋亡和抑制迁移侵袭效果。
结论：（1）雌激素在NSCLC中的促增殖作用是ERs依赖的；（2）ERs调节促存活蛋白和促凋亡蛋白的平衡从而抑制NSCLC细胞凋亡；（3）ERs通过调节EMT过程促进NSCLC细胞的迁移和侵袭；（4）ERs增强 Notch1通路蛋白的表达和活化，并通过GSK3β或其他旁路途径增加β-Catenin蓄积；（5）17β-E2在一定浓度范围内可增强ERs、Notch1通路相关蛋白与β-Catenin的表达，Fulvestrant的作用则刚好与17β-E2相反；（6）ERs作为EGFR和Notch1通路的冗余途径在信号网络中起促癌作用，EGFR和Notch1通路被抑制时，ERs可重新激活信号网络并介导高水平的输出，从而促进NSCLC进展；（7）ERs信号的冗余性加剧了EGFR TKI耐药，联合抑制ERs可作为克服NSCLC EGFRTKI耐药的潜在策略。
第三部分 ERs、EGFR和Notch1联合高表达与NSCLC不良预后相关
目的：探究ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达水平与NSCLC预后的关系。
方法：IHC检测人NSCLC组织芯片中ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达，Kaplan-Meier方法分析ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达水平与生存期之间的关系。
结果：（1）ERα、ERβ与EGFR在NSCLC癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织（p=0.0019，p＜0.0001，p=0.0009）。ERα、ERβ、EGFR与Notch1在癌组织的IHC评分均高于癌旁组织（ERα：p＜0.0001；ERβ：p＜0.0001；EGFR：p=0.0053；Notch1：p=0.0052）。（2）ERα、ERβ、EGFR、Notch1的表达水平与NSCLC早期患者的生存期无关，但ERα、ERβ、EGFR在中晚期NSCLC患者中的高表达与更差的10年生存期有关（p=0.0487；p=0.0419；p=0.0422）。（3）ERα、ERβ与EGFR三者中，同时高表达的受体越多，中晚期NSCLC患者的生存期越差（p=0.0042）。（4）ERα、ERβ与EGFR三者中至少二者高表达的中晚期NSCLC患者中，Notch1高表达与更差的生存期有关（p=0.0404）。
结论：ERα、ERβ、EGFR与Notch1均在NSCLC癌组织中表达增强，他们均可能是NSCLC的不良预后因子。ERα、ERβ、EGFR与Notch1的高表达可联合促进NSCLC的不良预后。
第一部分 ESR1/2可影响NSCLC中重要的膜受体信号通路
目的：基于TCGA NSCLC基因表达数据分析，探究ESR1/2对NSCLC基因表达谱的影响。
方法：从UCSC Xena在线数据库获取TCGANSCLC基因表达数据集，采用R软件包“limma”进行基因差异表达分析，评估ESR1/2表达水平高低对NSCLC肿瘤组织样本中其他基因的表达的影响；筛选出差异表达基因（differential expression genes， DEGs），将DEGs作为目标基因集，采用在线工具DAVID Functional Annotation Tool进行基因本体（Gene ontology，GO）功能和京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路注释，初步探讨ESR1/2对NSCLC关键分子事件和信号通路的潜在影响。
结果：差异表达分析结果显示有1237个基因在不同ESR1水平下具有显著的表达差异（∣Log2FC∣＞1且p＜0.05）。GO功能和KEGG通路富集结果显示，High-ESR1组中769个表达上调的DEGs主要富集于信号转导、免疫和炎症响应、细胞粘附、受体结合和激活等项中。High-ESR1组中468个表达下调的DEGs主要富集于转录调控、氧化还原过程、钙离子结合、CYP450相关代谢等项中。对于ESR2，有102个DEGs被筛选出来，High-ESR2组中95个上调的DEGs主要富集于细胞粘附、肢体形态发生、上皮细胞分化、钙离子结合、结构分子活性和GABA能神经突触等项中。High-ESR2组中7个下调的 DEGs的富集分析无显著性结果。对于 GO功能的细胞组分，ESR1和ESR2组中的DEGs均主要富集于质膜和细胞外空间。此外，富集于上述GO和KEGG项中的 DEGs还参与许多膜受体信号传导通路，如生长因子信号通路、Wnt/GSK/β-Catenin通路和Notch通路。
结论：ESR1/2可能影响NSCLC中许多重要的分子事件和信号通路，尤其是膜相关的细胞通讯相关过程，包括受体激活、信号转导、细胞粘附、免疫反应等。更为关键的提示是ESR1/2可能通过调节重要的膜受体信号通路来影响NSCLC的发生发展。因此，在接下来的研究中，我们将验证 ERs对 EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路的调节作用及对NSCLC进展的影响。
第二部分 ERs调节膜受体信号网络促进NSCLC的发生发展
目的:探究 ERs对 NSCLC细胞行为的影响，以及 ERs对 EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路和由此构成的信号网络的调节作用。
方法：（1）不同浓度的17β-E2（0、10、20 nM）处理细胞72 h之后，CCK-8检测各NSCLC细胞株的增殖情况；Western Blot检测各细胞株中ERα和ERβ的表达情况。
（2）在PC9/G和H1299细胞中转染si-ERα/si-ERβ后，Western Blot检测沉默ERs对凋亡相关蛋白、迁移侵袭相关蛋白表达的影响；转染 si-ERα/si-ERβ或氟维司群（Fulvestrant，Ful）预处理后，吉非替尼（Gefitinib，Gef）或空白对照二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）孵育细胞48 h，流式细胞术检测沉默ERs对细胞凋亡比率的影响，Transwell检测ERs对细胞迁移侵袭能力的影响。
结果：1. ERs促进NSCLC细胞增殖、迁移侵袭和凋亡逃逸
（1）E2处理显著增强了PC9/G、PC9与H1299细胞的增殖能力（p＜0.05），但对A549、H1975与HCC827细胞的增殖没有影响；ERα与ERβ在PC9/G、PC9与H1299细胞中显著高表达，而在A549、H1975与HCC827细胞中的表达水平相对较低。
（2） si-ERα与si-ERβ分别沉默ERα和ERβ后，均可增加PC9/G和H1299细胞的凋亡（p＜0.05）；且与单用Gefitinib相比，si-ERs与Gefitinib联合可显著提高PC9/G和H1299细胞的凋亡率（p＜0.05）。si-ERα与si-ERβ均可下调PC9/G和H1299细胞中Survivin和Bcl-2的表达（p＜0.05），上调Cleaved Caspase3的表达（p＜0.05）。Bim的表达在PC9/G细胞中被si-ERs上调（p＜0.05），在H1299细胞中不受影响。
2. ERs调节EGFR、Notch1、GSK3β/β-Catenin通路中关键节点蛋白的表达和活化
（1） si-ERs下调PC9/G和H1299细胞中Notch1、NICD、Hes1和β-Catenin的表达（p＜0.05）。si-ERs还下调H1299细胞中GSK3β的表达同时上调GSK3β的磷酸化（p＜0.05）。PC9/G细胞中GSK3β与pGSK3β的表达水平未受到si-ERs的影响。
（2）PC9/G细胞中，E2（10、20 nM）可上调ERα与ERβ的表达（p＜0.05）。E2也调节Notch1通路关键蛋白的表达。10或20 nME2可同时上调Notch1、NICD和Hes1的表达（p＜0.05）；而高浓度的E2（50 nM）上调Hes1表达（p＜0.05），下调Notch1的表达（p＜0.05），对NICD的表达没有明显影响。E2可以小幅度上调β-Catenin的表达（p＜0.05），但并不影响GSK3β的表达。
3.膜受体信号网络模型的构建和模拟仿真
（1）基于EGFR、Notch1和GSK3β/β-Catenin通路相关蛋白的经时表达数据构建了ERs、EGFR、Notch1和GSK3β/β-Catenin通路串话的常微分方程（Ordinary differential equations，ODEs）模型，得到的信号网络包括66个反应，43个节点和98个参数。当EGF，E2和Dll1均处于低水平（All low group）时，模型输出维持在低水平。
（2）模型预测显示，即使EGFR通路被抑制，ERs的过度活化也会重新激活EGFR，从而导致EGFR TKI耐药。实验证实Gefitinib和Fulvestrant联合作用于NSCLC细胞显示出更好的肿瘤抑制效果；对于Gefitinib耐药的PC9/G和H1299细胞，沉默ERs也可增强Gefitinib的促凋亡和抑制迁移侵袭效果。
结论：（1）雌激素在NSCLC中的促增殖作用是ERs依赖的；（2）ERs调节促存活蛋白和促凋亡蛋白的平衡从而抑制NSCLC细胞凋亡；（3）ERs通过调节EMT过程促进NSCLC细胞的迁移和侵袭；（4）ERs增强 Notch1通路蛋白的表达和活化，并通过GSK3β或其他旁路途径增加β-Catenin蓄积；（5）17β-E2在一定浓度范围内可增强ERs、Notch1通路相关蛋白与β-Catenin的表达，Fulvestrant的作用则刚好与17β-E2相反；（6）ERs作为EGFR和Notch1通路的冗余途径在信号网络中起促癌作用，EGFR和Notch1通路被抑制时，ERs可重新激活信号网络并介导高水平的输出，从而促进NSCLC进展；（7）ERs信号的冗余性加剧了EGFR TKI耐药，联合抑制ERs可作为克服NSCLC EGFRTKI耐药的潜在策略。
第三部分 ERs、EGFR和Notch1联合高表达与NSCLC不良预后相关
目的：探究ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达水平与NSCLC预后的关系。
方法：IHC检测人NSCLC组织芯片中ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达，Kaplan-Meier方法分析ERα、ERβ、EGFR和Notch1的表达水平与生存期之间的关系。
结果：（1）ERα、ERβ与EGFR在NSCLC癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织（p=0.0019，p＜0.0001，p=0.0009）。ERα、ERβ、EGFR与Notch1在癌组织的IHC评分均高于癌旁组织（ERα：p＜0.0001；ERβ：p＜0.0001；EGFR：p=0.0053；Notch1：p=0.0052）。（2）ERα、ERβ、EGFR、Notch1的表达水平与NSCLC早期患者的生存期无关，但ERα、ERβ、EGFR在中晚期NSCLC患者中的高表达与更差的10年生存期有关（p=0.0487；p=0.0419；p=0.0422）。（3）ERα、ERβ与EGFR三者中，同时高表达的受体越多，中晚期NSCLC患者的生存期越差（p=0.0042）。（4）ERα、ERβ与EGFR三者中至少二者高表达的中晚期NSCLC患者中，Notch1高表达与更差的生存期有关（p=0.0404）。
结论：ERα、ERβ、EGFR与Notch1均在NSCLC癌组织中表达增强，他们均可能是NSCLC的不良预后因子。ERα、ERβ、EGFR与Notch1的高表达可联合促进NSCLC的不良预后。